При диагностицирането на инфекциозни заболявания се използват различни лабораторни методи за откриване на патогени. Един от най -прогресивните, специфични и точни лабораторни тестове е PCR анализът, който ви позволява да определите наличието на патогени в кръвта и други видове биологичен материал, да откриете микроорганизми в ранните етапи от развитието на болестта, в случаите на носител на инфекция.
PCR анализ на специално оборудване
Как се извършват диагностични тестове с помощта на PCR
Полимеразната верижна реакция е лабораторен молекулярно -биологичен метод за откриване на ДНК на бактерии и гъбички, ДНК и РНК на вируси. Основата на PCR е специална ензимна реакция, която протича в присъствието на специални ензими и вещества с молекулен характер. Поради факта, че методът е в състояние директно да фиксира наличието на причинителя на заболяването, той се счита за най -информативен и чувствителен при откриване на латентни инфекции и пренасяне в сравнение с всички други диагностични методи.
Анализът на биологични проби с помощта на PCR тестване ви позволява бързо да откриете наличието на самите бактерии и вируси.
Други лабораторни диагностични методи, като правило, определят непреки признаци на инфекция или изискват продължителна процедура на изпитване.
Основните етапи на PCR техниката са:
- вземане на биологичен материал, доставяне в диагностичната лаборатория,
- изолиране на генетичния материал на бактерии и вируси от взетия материал,
- директен анализ на PCR и декодиране на получените данни.
За да се установи PCR реакция, се използват проби от течности, тъкани, тайни, в които се предполага наличието на патогени. Най -често използваните проби за тестване са венозна кръв, плазма или серум. В лабораторията бактериалните и вирусни частици се отделят от други компоненти и с помощта на специални реактиви се изолират молекули ДНК или РНК от тях.
Полимеразна верижна реакция
На следващия етап тези генетични молекули се умножават многократно в специални устройства. За това се използват специални ензими и молекули, които позволяват изкуствено да се размножава строго определен тип ДНК, принадлежащ само на един специфичен патоген. В резултат на реакцията се образуват огромен брой къси ДНК фрагменти, идентични с тези, които са част от вируси и бактерии.
На третия етап натрупаните фрагменти се откриват с помощта на специални багрила и оборудване за откриване. Ако първоначалната проба съдържа патогени, в резултат на реакцията се образува специфичен продукт и анализът показва положителен резултат. Ако патогенът не е в материала, реакционният продукт не се синтезира и тестът дава отрицателен резултат.
PCR изследването е един от най -бързите начини за диагностициране на инфекции. Пълният цикъл на проверка на материала отнема от няколко часа до един ден.
PCR метод - същността
Използването в реакцията на многократно възпроизвеждане на ДНК молекули от строго определен тип дава възможност за точно определяне на наличието на микроорганизми в биологични проби с изключителна чувствителност. Дори малка концентрация на инфекциозни агенти в тъканите и телесните течности може да доведе до синтез на огромно количество от реакционния продукт и положителен извод.
Какви инфекции се определят чрез PCR теста
С помощта на PCR технологията се открива наличието на голямо разнообразие от бактерии, подобни на дрожди клетки, вирусни частици. В съвременната диагностична практика най -често PCR анализът идентифицира причинителите на следните заболявания:
- HIV инфекция (СПИН),
- хепатит (хепатит В, хепатит С и други по -редки видове),
- цитомегаловирусна инфекция,
- почти всички инфекциозни заболявания на пикочно -половата система,
- кандидоза,
- микоплазмоза,
- инфекции, причинени от херпесни вируси,
- папиломавирусна инфекция,
- токсоплазмоза,
- чревни заболявания,
- дифтерия,
- туберкулоза,
- редки фокални инфекции,
- мононуклеоза и много други.
Полимеразната верижна реакция е най -разпространеният, надежден и бърз метод за откриване на генитални инфекции, хепатит, ХИВ, папиломи и други заболявания.
За много диагностицирани заболявания, PCR не е единственият диагностичен метод. Диагнозата се потвърждава от лекар само когато се наблюдават други признаци на заболяването.
Схема за откриване на вируси и бактерии
Но в редица случаи полимеразната реакция е "златният стандарт" на лабораторната диагностика.
Списъкът на инфекциите, открити чрез PCR, се разширява всяка година. Развитието на метода вече даде възможност да се определят едновременно няколко патогена. Това послужи за разпространение на цялостни програми за проучване. Сред тях: цялостно проучване на микрофлората за бактериална вагиноза, определяне на TORCH инфекции, идентифициране на човешки папиломи с висок и нисък канцерогенен риск. В допълнение, PCR кръвен тест е включен в задължителния болничен диагностичен комплекс.
Използвайки полимеразната реакция, учените успяха да идентифицират молекули, които сигнализират за развитието на различни форми на злокачествени тумори - туморни маркери. Благодарение на това методът намери приложение при ранното откриване на рак. PCR тестовете се използват активно за откриване на наследствени генетични дефекти, включително при пренатална диагностика и по време на планиране на бременност.
Характеристики на биологичния материал за PCR анализ
Събирането на определен вид материал за изследване се определя от вида инфекция, която те искат да диагностицират в резултат на тестване. Следните проби се вземат като тестови проби:
- венозна кръв
- слюнка,
- остъргвания, например от цервикалния канал, от вътрешната страна на бузата,
- проби от слуз,
- урина,
- плеврална течност
- секрети от сперма и простата,
- храчки и бронхо-белодробна промивка,
- отделяне от уретрата.
Резултатите могат да бъдат дешифрирани само от специалисти
За индивидуални инфекции и за специални показания лекарите могат да предпишат тест за цереброспинална течност. При откриване на вътрематочни заболявания се използват проби от плацентата и околоплодната течност.
По принцип за диагностика с помощта на PCR се използва видът материал, в който най -вероятно е причинителят на самото заболяване. Видът на биологичния материал се определя от лекаря, когато се позовава на анализа.
За да бъде анализът точен и правилен, е необходима проста подготовка преди вземане на проби и спазване на особената чистота на вземане на проби и извършване на самия анализ.
За да получите точен резултат от анализа, трябва да се придържате към няколко правила за подготовка и събиране на материал за изследване:
- да се откаже от полов акт няколко дни преди вземане на материал от гениталиите и в случай на диагностициране на генитални инфекции чрез кръвен тест,
- вземете венозна кръв за PCR анализ сутрин, не консумирайте напитки и храна преди раждането,
- не пушете поне два часа преди даряване на кръв,
- Съберете урината в стерилен контейнер веднага след сън.
Важно! Приемът на антибиотици и други лекарства може да изкриви резултатите от теста. Преди да изпратите материала, трябва да се консултирате с Вашия лекар.
Ако за извършване на PCR анализ се планира да се вземе материал от гениталиите, се препоръчва да се отмени употребата на антибактериални хигиенни продукти и мощни лекарства след консултация с лекуващия лекар.
Как да дешифрираме резултата от PCR анализа
Резултатите от PCR обикновено се представят в качествен формат. Инфекциозен агент или се открива в проба от биологичен материал, или не се открива в него.
Тълкуването на заключението в този случай е възможно най -просто:
- положителен резултат показва, че микроорганизмът е присъствал в анализираната проба,
- отрицателен тест показва, че не е открит инфекциозен агент.
Внимание! Отрицателният резултат понякога е резултат от неправилно вземане на проби или грешки в процеса на анализ.
При наличие на очевидни симптоми на заболяването и съмнение за фалшиво отрицателен резултат може да е препоръчително да се повтори изследването.
PCR анализът изисква голяма точност
В специални случаи се използват количествени методи за определяне на патогена. Резултатите от такива анализи се издават под формата на получената концентрация на ДНК или РНК на патогена по отношение на определен обем материал. Например, в копия на ДНК молекули на милилитър кръвна плазма.
Извършва се количествен и полуколичествен PCR анализ и интерпретация на резултатите от него, за да се проследи хода на заболяването, да се определи вирусното натоварване, да се идентифицира стадият на заболяването и да се диагностицират заболявания, причинени от условни патогени.
Положителни аспекти на PCR диагностиката
Активното въвеждане на метода на полимеразна верижна реакция при диагностицирането на такъв широк спектър от инфекциозни заболявания стана възможно поради редица негови предимства:
- висока специфичност на метода - анализът ви позволява да откриете строго определен тип ДНК на патогени,
- възможността за настройване на анализа в потока и автоматизиране на процеса,
- висока чувствителност на метода и способност за диагностициране на заболяването в ранен стадий,
- диагностика на няколко инфекции едновременно;
- бързина на процедурата и ниска цена на консумативите.
Недостатъците на метода включват необходимостта от скъпо оборудване, високи изисквания за чистотата и технологичността на лабораторията, възможността за получаване на фалшиви резултати, ако методът на анализ не се спазва.
За адекватно и ефективно лечение на много инфекциозни заболявания е необходимо своевременно установяване на точна диагноза. В решаването на този проблем в днешно време се използват високотехнологични диагностични методи, базирани на методите на молекулярната биология. В момента полимеразната верижна реакция (PCR) вече се използва широко в практическата медицина като най -надеждният инструмент за лабораторна диагностика.
Какво обяснява популярността на PCR в момента?
Първо, този метод се използва за идентифициране на причинителите на различни инфекциозни заболявания с висока точност.На второ място, да се следи ефективността на лечението.
В различни ръководства, брошури, статии, както и обяснения на медицински специалисти, често се натъкваме на употребата на неразбираеми термини и думи. Наистина е трудно да се говори за високотехнологични продукти на науката с обикновени думи.
Каква е същността и механиката на PCR диагностиката?
Всеки жив организъм има свои уникални гени. Гените се намират в молекулата на ДНК, която всъщност е „визитната картичка“ на всеки конкретен организъм. ДНК (генетичен материал) е много дълга молекула, съставена от градивни елементи, наречени нуклеотиди. За всеки причинител на инфекциозни заболявания те се намират строго конкретно, тоест в определена последователност и комбинация. Когато е необходимо да се разбере дали човек има определен патоген, се взема биологичен материал (кръв, урина, слюнка, намазка), който съдържа ДНК или фрагменти от ДНК на микроба. Но количеството генетичен материал на патогена е много малко и е невъзможно да се каже към кой микроорганизъм принадлежи. За да се реши този проблем, се използва PCR. Същността на полимеразната верижна реакция е, че се взема малко количество материал за изследване, съдържащ ДНК, а по време на PCR процеса настъпва увеличаване на количеството генетичен материал, принадлежащ на специфичен патоген, и по този начин може да бъде идентифициран.PCR диагностиката е генетично изследване на биоматериал.
Идеята за PCR метода принадлежи на американския учен К. Мълинс, който той предлага през 1983 г. Широко клинично приложение обаче получава едва в средата на 90 -те години на ХХ век. Нека да разберем терминологията, какво е това - ДНК и т.н. Всяка клетка на всяко живо същество (животно, растение, човек, бактерии, вирус) има хромозоми. Хромозомите са пазители на генетичната информация, която съдържа цялата последователност от гени на всяко конкретно живо същество.
Всяка хромозома се състои от две нишки ДНК, усукани в спирала една спрямо друга. ДНК е химически дезоксирибонуклеинова киселина, която се състои от структурни компоненти - нуклеотиди. Има 5 вида нуклеотиди - тимин (Т), аденозин (А), гуанин (G), цитозин (С) и урацил (U). Нуклеотидите са разположени един след друг в строга индивидуална последователност, образувайки гени. Един ген може да се състои от 20-200 такива нуклеотида. Например, кодиращият ген за производството на инсулин е с дължина 60 базови двойки.
Нуклеотидите имат свойството на допълване. Това означава, че противоположно на аденина (А) в една ДНК верига задължително има тимин (Т) в другата верига, а противоположно на гуанин (G) - цитозин (С). Схематично изглежда така:
G - C
Т - А
А - Т
Това свойство на допълване е ключово за PCR.
В допълнение към ДНК, РНК има същата структура - рибонуклеинова киселина, която се различава от ДНК по това, че използва урацил вместо тимин. РНК - е пазител на генетичната информация при някои вируси, които се наричат ретровируси (например ХИВ).
ДНК и РНК молекулите могат да се "размножават" (това свойство се използва за PCR). Това се случва по следния начин: две нишки ДНК или РНК се раздалечават една от друга, на всяка верига седи специален ензим, който синтезира нова верига. Синтезът протича по принципа на комплементарност, тоест ако в първоначалната ДНК верига има нуклеотид А, то в новосинтезирания ще има Т, ако G - тогава С и т.н. Този специален ензим - "строител" за началото на синтеза се нуждае от "семе" - последователност от 5-15 нуклеотида. Това "семе" е дефинирано за всеки ген (хламидиен ген, микоплазма, вируси) експериментално.
И така, всеки PCR цикъл се състои от три етапа. На първия етап настъпва т. Нар. Размотаване на ДНК - тоест разделяне на две свързани ДНК вериги. Във втория "семето" е прикрепено към част от веригата на ДНК. И накрая, удължаването на тези нишки на ДНК, което се произвежда от ензима "строител". Понастоящем целият този сложен процес се осъществява в една епруветка и се състои от повтарящи се цикли на възпроизвеждане на определената ДНК с цел получаване на голям брой копия, които след това могат да бъдат открити по конвенционални методи. Тоест от една верига ДНК получаваме стотици или хиляди.
Етапи на PCR изследване
Събиране на биологичен материал за изследване
Като проба се използват различни биологични материали: кръв и нейните компоненти, урина, слюнка, отделяне на лигавица, цереброспинална течност, отделяне от повърхностите на раната, съдържанието на телесните кухини. Всички биоанализи се събират с инструменти за еднократна употреба, а събраният материал се затваря в пластмасови стерилни епруветки или се поставя върху хранителна среда, последвано от транспортиране до лабораторията.Необходимите реактиви се добавят към събраните проби и се поставят в програмируем термостат - термичен цикъл (усилвател). В усилвателя, PCR цикълът се повтаря 30-50 пъти, състоящ се от три етапа (денатурация, отгряване и удължаване). Какво означава това? Нека разгледаме по -отблизо.
Етапи на директна PCR реакция, копиране на генетичен материал
АзPCR етап - Подготовка на генетичен материал за копиране.Това се случва при температура 95 ° C, докато нишките на ДНК са разделени и „семена“ могат да седнат върху тях.
"Семената" се произвеждат индустриално от различни изследователски и производствени асоциации, а лабораториите се купуват готови. В същото време "семето" за откриване, например, на хламидия, работи само за хламидия и т.н. Така, ако даден биоматериал се тества за наличие на хламидиална инфекция, тогава в реакционната смес се поставя "семе" за хламидия; ако даден биоматериал се тества за вируса на Epstein-Barr, той също е "семе" за вируса на Epstein-Barr.
IIетап - Комбиниране на генетичния материал на инфекциозния агент и "семето".
Ако има ДНК на открития вирус или бактерия, "семето" седи върху тази ДНК. Този процес на закрепване на "праймера" е вторият етап на PCR. Този етап се провежда при температура 75 ° C.
IIIетап - Копиране на генетичния материал на инфекциозния агент.
Това е процесът на действително удължаване или възпроизвеждане на генетичен материал, който протича при 72 ° C. Ензимът „строител“ се приближава до „семената“ и синтезира нова верига ДНК. С края на синтеза на нова ДНК верига, цикълът на PCR също приключва. Тоест, в един PCR цикъл, количеството генетичен материал се удвоява. Например, в оригиналната проба имаше 100 ДНК молекули от всеки вирус; след първия PCR цикъл вече ще има 200 ДНК молекули от тествания вирус в пробата. Един цикъл продължава 2-3 минути.
За да се генерира достатъчно количество генетичен материал за идентификация, обикновено се извършват 30-50 PCR цикъла, което отнема 2-3 часа.
Етап на идентификация на размножения генетичен материал
Самият PCR приключва на този етап и след това има еднакво значим етап на идентификация. За идентификация използвайте метода на електрофореза или с етикет "праймери". Когато се използва електрофореза, получените ДНК нишки се разделят по размер, а наличието на ДНК фрагменти с различна дължина показва положителен резултат от анализа (тоест наличието на определен вирус, бактерии и т.н.). Когато се използват маркирани "праймери", към крайния продукт на реакцията се добавя хромоген (багрило), в резултат на което ензимната реакция е придружена от образуване на цвят. Развитието на цвета директно показва, че в оригиналната проба присъства вирус или друг откриваем агент. Днес, използвайки етикети "праймери", както и подходящ софтуер, човек може веднага да "прочете" резултатите от PCR. Това е така наречената PCR в реално време.
Защо PCR диагностиката е толкова ценна?
Едно от значимите предимства на PCR метода е неговата висока чувствителност - от 95 до 100%. Тези предимства обаче трябва да се основават на задължителното спазване на следните условия:
- правилно събиране, транспортиране на биологичен материал;
- наличие на стерилни инструменти за еднократна употреба, специални лаборатории и обучен персонал;
- стриктно спазване на техниката и стерилност по време на анализа
Възможностите, присъщи на PCR анализа, ви позволяват да постигнете ненадмината аналитична специфичност. Това означава да идентифицирате точно търсения микроорганизъм, а не подобен или тясно свързан.
Диагностичната чувствителност и специфичност на PCR метода често превъзхождат тези на културния метод, наречен "златен стандарт" за откриване на инфекциозни заболявания. Като се има предвид продължителността на растежа на културата (от няколко дни до няколко седмици), предимството на PCR метода става очевидно.
PCR при диагностициране на инфекции
Предимствата на PCR метода (чувствителност и специфичност) определят широк спектър от приложения в съвременната медицина.
Основните области на приложение на PCR диагностиката:
- диагностика на остри и хронични инфекциозни заболявания с различна локализация
- наблюдение на ефективността на терапията
- изясняване на вида на патогена
Използването на PCR диагностика се извършва заедно с други методи на изследване (ELISA, PIF, RIF и др.). Тяхната комбинация и целесъобразност се определя от лекуващия лекар.
Инфекциозни агенти, открити чрез PCR
Вируси:
- ретровируси HIV-1 и HIV-2
- херпетиформни вируси
- вирус на херпес симплекс тип 1 и 2
Полимеразна верижна реакция (PCR, PCR - полимеразна верижна реакция) е метод за получаване на множество копия на специфични ДНК фрагменти (гени) в биологична проба.
Същността на PCR като метод на молекулярната биология се състои в многократно селективно копиране на определен ген (ДНК участък) с помощта на специални ензими при условия инвитро... Важна характеристика на PCR е получаването на копия от специфичен регион на ДНК (ген), който отговаря на посочените условия. Синоним на процеса на копиране на ДНК е "амплификация". ДНК репликация in vivoможе също да се счита за усилване. Въпреки това, за разлика от репликацията, късите участъци от ДНК (максимум 40 000 базови двойки) се амплифицират по време на полимеразната верижна реакция.
Основни принципи
И така, PCR е многократното копиране на определени фрагменти от ДНК in vitro по време на повтарящи се температурни цикли. Как протича реакционният процес в рамките на един температурен цикъл?
Образуването на нуклеотидна верига се осъществява от ензима ДНК полимераза. Въпреки това, за да започне, ензимът се нуждае от стартова площадка. Сайтовете са "праймери" (праймери) - синтетични олигонуклеотиди с дължина 15-20 нуклеотида. Трябва да има два праймера (напред и назад), те са комплементарни към регионите на ДНК матрицата и именно ДНК фрагментът, ограничен от праймерите, ще бъде многократно копиран от ДНК полимераза. Работата на полимеразата е последователното добавяне на нуклеотиди, които са комплементарни на последователността на ДНК матрицата. Така в един температурен цикъл отново се синтезират два нови ДНК фрагмента (тъй като молекулата на ДНК е двуверижна, тогава първоначално има две матрици). По този начин, за 25-35 цикъла, милиарди копия от ДНК областта, определена от праймерите, се натрупват в епруветката. Структурата на отделен цикъл може да бъде представена по следния начин:
- Денатурация на ДНК (топене, дивергенция на нишки на ДНК) - 95 ° С - 1 или 2 минути;
- отгряване на праймери (праймери се свързват с ДНК матрицата, температурата на този етап се определя от нуклеотидния състав на праймера) - 60 ° C (например) - 1 минута;
- Удължаване на ДНК (полимеразата синтезира ДНК верига) - 72 ° C - 1 минута (времето зависи от дължината на синтезирания фрагмент).
Инструменталната база за прилагането на метода на полимеразна верижна реакция в лабораторията трябва да се състои от:
- (или, както се нарича още, термичен цикъл);
- системи за s (за визуализация на резултатите от PCR);
- системи (за анализ на резултатите от PCR);
- (за подготовка на пробата);
- набиране (механично или електронно).
В допълнение към основното и спомагателното оборудване за пълноценното функциониране на лабораторията за PCR, са необходими някои консумативи: стерилни накрайници, епруветки, стелажи за епруветки и дозатори.
Реагентната база в конвенционална PCR лаборатория за провеждане на пълноценна полимеразна верижна реакция включва ензимната ДНК полимераза с буфер, праймери (малки синтетични фрагменти на ДНК, допълващи началото и края на анализираната област на ДНК матрицата), смес от нуклеотиди (A, T, D, Ts). Пречистената вода също е абсолютно необходима.
Предимства на PCR метода
Висока чувствителност на изследването
Чувствителността на метода е такава, че е възможно да се амплифицира в PCR и да се идентифицира целевата последователност, дори ако се появи веднъж в проба от 105 клетки.
Специфика на анализа
PCR позволява откриване на ДНК на специфичен инфекциозен агент в присъствието на ДНК на други микроорганизми и ДНК на организма гостоприемник, както и извършване на генотипиране. Чрез специално избиране на реакционните компоненти (праймери), можете едновременно да откриете ДНК на близко свързани микроорганизми.
Универсалност на PCR метода
Факт е, че за PCR диагностика на инфекциозни заболявания или наследствени човешки болести може да се използва едно и също оборудване, универсални процедури за подготовка на проби (проби) и анализ, както и един и същи тип комплекти реактиви.
Спести време
Важно предимство на PCR е липсата на етапи от културната микробиологична работа. Подготовката на пробата, реакцията и анализът на резултатите са максимално улеснени и автоматизирани в много отношения. Благодарение на това времето за получаване на резултата може да бъде намалено до 4-5 часа.
Ефективността на PCR метода
Широчината на изучения клиничен материал
Като проба в полимеразната верижна реакция може да се използва не само биологичен материал от пациента, но и много други субстрати, в които могат да бъдат идентифицирани ДНК молекули с висока чувствителност, например вода, почва, храна, микроорганизми, промивки и много други още ....
Всички горепосочени предимства на този уникален метод - висока чувствителност и специфичност, идентифициране на инфекциозен агент и генотипизиране на всеки човешки ген, висока ефективност и спестяване на време, гъвкавост на инструменталната база - позволяват PCR методът да бъде широко използван днес в клиниката диагностика, медицинска практика, научни изследвания, контрол на качеството и много други области.
PCR приложение
Областите на приложение на полимеразната верижна реакция като съвременен метод на молекулярната биология са разнообразни. Това до голяма степен се дължи на широчината на материала, който може да бъде анализиран (почти всичко, от което може да се изолира повече или по-малко висококачествена ДНК, може да стане обект на изследване), както и избраните праймери. Основните области на приложение на PCR:
клинична медицина
- диагностика на инфекциозни заболявания
- диагностика на наследствени заболявания
- идентифициране на мутации
- генотипиране
- клетъчни технологии
- създаване на генетични паспорти
екология
- мониторинг на околната среда
- анализ на храните
- анализ на генетично модифицирани организми (ГМО)
съдебна медицина и съдебна медицина
- идентификация на самоличността
- установяване на бащинство
фармакология
ветеринарен
научни изследвания (молекулярна биология, генетика)
Организиране на лаборатория за PCR
Информация за поръчка
| Име | Сила на звука | Производство | Метод | Кат.номер |
|---|---|---|---|---|
Сайтът предоставя основна информация само за информационни цели. Диагностиката и лечението на заболяванията трябва да се извършват под наблюдението на специалист. Всички лекарства имат противопоказания. Необходима е консултация със специалист!
Метод полимеразна верижна реакцияе открит преди почти тридесет години от американски учен на име Кари Мълис... Техниката е широко разпространена в медицината като диагностичен инструмент и нейната същност се състои в копиране на парче ДНК с помощта на специален ензим ( полимераза) изкуствено в епруветка.В кои области на медицината се използва този метод?
Защо се извършва копиране на ДНК и как може да служи на медицината?Тази техника позволява:
- Изолирайте и клонирайте гени.
- Диагностика на генетични и инфекциозни заболявания.
- Определете бащинството. Детето частично наследява генетични характеристики от своите биологични родители, но в същото време има своя уникална генетична идентификация. Наличието на някои гени, идентични с родителските в него - ни позволява да говорим за установяване на родство.
На местопрестъплението криминалисти събират проби от генетичен материал. Те включват: коса, слюнка, кръв. Впоследствие, благодарение на техниката на полимеразна реакция, е възможно да се амплифицира ДНК и да се сравни идентичността на взетата проба с генетичния материал на заподозрения.
В медицината полимеразната верижна реакция се използва ефективно:
- В белодробната практика - за диференциране на бактериални и вирусни видове пневмония, туберкулоза.
- В гинекологичната и урологичната практика - за определяне на уреаплазмоза, хламидия, микоплазмена инфекция, гарднерелоза, херпес, гонорея.
- В гастроентерологичната практика.
- В хематологията - за определяне на онковируси и цитомегаловирусна инфекция.
- При бързата диагностика на инфекциозни заболявания като вирусен хепатит, дифтерия, салмонелоза.
Понастоящем този метод е най -често срещан при диагностицирането на инфекциозни заболявания ( хепатит с вирусна етиология, ХИВ, болести, предавани по полов път, туберкулоза, кърлежов енцефалит).
Какво се случва по време на реакцията?
Самата реакция е химически неусложнена. Източникът на ДНК за реакцията може да бъде капка кръв, коса, парче кожа и т.н. На теория една реакция изисква правилните реактиви, епруветка, биологична проба и източник на топлина. Полимеразната реакция дава възможност да се открие инфекция, дори ако в пробата с биологичния материал има само една или няколко ДНК молекули на патогена.
По време на реакцията, благодарение на ензима ДНК полимераза, се случва удвояване ( репликация) парче ДНК. Същата дезоксирибонуклеинова киселина ( съкратена ДНК) е важно за нас, тъй като осигурява съхранение и пренос на генетична информация към дъщерни клетки. ДНК има формата на спирала, която се състои от повтарящи се блокове. Тези блокове изграждат нуклеотиди, които са най -малкото парче ДНК. Нуклеотидите се образуват от аминокиселини.
Процесът на репликация на участъци от ДНК протича по време на повтарящи се цикли. Във всеки такъв цикъл се копира и удвоява не само оригиналният ДНК фрагмент, но и онези фрагменти, които вече са се удвоили в последния амплификационен цикъл. Всичко това прилича на процес на геометрична прогресия.
Съществува:
- Естествено усилване ( тоест процесът на копиране и умножаване на ДНК), което се случва в нашето тяло и е детерминиран, предварително определен процес.
- Изкуствено усилване, което се случва чрез полимеразна верижна реакция. В този случай процесът на копиране се контролира и ви позволява да дублирате дори кратки участъци от нуклеинова киселина.
Тридесет или четиридесет цикъла по -късно броят на фрагментите достига няколко милиарда.
За усилване инвитро (инвитро) е необходимо специфичен чужд ДНК фрагмент ( тоест ДНК не е на пациента, а на патогена). Ако в създадения разтвор няма специфичен фрагмент, верижната реакция под действието на полимераза няма да продължи. Това обяснява високата специфичност на PCR.
Етапи на PCR диагностика
1. ДНК се изолира от тестовия материал.2. ДНК се добавя към специален разтвор на нуклеотиди.
3. Разтворът се загрява до температура от 90 - 95 градуса по Целзий, за да може ДНК протеинът да се коагулира.
4. Намалете температурата до 60 градуса.
5. С повтарянето на циклите на повишаване и намаляване на температурата, броят на регионите на нуклеинова киселина се увеличава.
6. Резултатите се сумират чрез електрофореза и се изчисляват резултатите от удвояването.
Какви са предимствата на тази диагноза?
- Универсалност: Всяка проба от нуклеинова киселина е подходяща за този метод.
- Висока специфичност: патогенът има уникални последователности от специфични за него нишки на ДНК. Следователно резултатите от извършената PCR ще бъдат надеждни, невъзможно е да се обърка гена на един патоген с гена на друг патоген.
- Чувствителност към наличието на дори една молекула на патогена.
- Малко количество материал, необходим за изследване. Дори една капка кръв ще е достатъчна. Способността да се получи резултат с минимален обем на пробата е много важна за педиатричните, неонатологичните, неврологичните изследвания, както и в практиката на съдебната медицина.
- Способността да се идентифицира бавна, хронична инфекция, а не само остра.
- Много болестотворни култури са много трудни за култивиране in vitro по други методи, а полимеразната реакция позволява културата да се размножава в необходимото количество.
Какви са недостатъците на тази диагноза?
- Ако материалът, предназначен за PCR, съдържа ДНК не само на жив патоген, но и на починал, ще настъпи амплификация на двете ДНК. Съответно, лечението след диагностициране може да не е напълно правилно. След известно време е по -добре да проверите ефективността на лечението.
- Свръхчувствителността към наличието на микроорганизми също може да се счита по някакъв начин като недостатък. Всъщност нормално в човешкото тяло има условно патогенна микрофлора, тоест това са микроорганизми, които живеят в червата, стомаха и други вътрешни органи. Тези микроорганизми могат да навредят на човек само при определени неблагоприятни условия - неспазване на хигиенните изисквания, замърсена питейна вода и т.н. PCR техниката усилва ДНК дори на тези микроорганизми, въпреки че те не водят до патология.
- PCR на различни тестови системи може да покаже резултати, които ще се различават помежду си. Има много модификации на тази техника: „ вложен», « асиметрични», « обърнат», « количествен»PCR и други.