/ 16
ХудшийЛучший
Обследованию на ВИЧ-инфекцию подлежат:
2. Лица с подозрением или подтвержденным диагнозом: бактериальной инфекции у детей младше 13 лет, множественной и рецидивирующей; кандидоза пищевода, трахеи, бронхов или легких; цервикального инвазивного рака; диссеминированного или внелегочного кокцидиомикоза; криптококкоза внелегочного; криптоспоридиоза с диареей в течение 1 мес и более; цитомегаловирусного поражения других органов, кроме печени, селезенки, лимфатических узлов у больных старше 1 мес; цитомегаловирусного ретинита с потерей зрения; герпетической инфекции, вызывающей многоочаговые язвы, которые не излечиваются на протяжении 1 мес, или бронхит, пневмонию, эзофагит; гистоплазмоза диссеминированного или внелегочного; изоспороза с диареей свыше 1 мес; туберкулеза распространенного или внелегочного; туберкулеза легких у взрослых или подростков старше 13 лет; туберкулеза внелегочного; другого заболевания, вызванного микобактериями, кроме М. tuberculosis диссеминированного или внелегочного; пневмонии, вызванной пневмоцистами; прогрессирующей многофокусной лейкоэнцефалопатии; сальмонеллезной (кроме Salmonella typhi) септицемии, рецидивирующей; токсоилаз-моза мозга у детей старше 1 мес; саркомы Капоши; лимфоидной интерстициальной пневмонии у детей младше 13 лет; лимфомы Беркитта; иммунобластной лимфомы; первичной лимфомы мозга; синдрома истощения, гепатита В, носительства HBsAg; инфекционного мононуклеоза; рецидивирующего опоясывающего герпеса у лиц старше 60 лет; болезней, передающихся половым путем.
В высокоспециализироваиной лаборатории проводятся:
а) определение циркулирующих в крови антител, антигенов и иммунных комплексов; культивирование вируса, выявление его геномного материала и ферментов;
б) оценка функций клеточного звена иммунной системы. Основная роль принадлежит методам серологической диагностики, направленным на определение антител, а также антигенов возбудителя в крови и других биологических жидкостях организма.
Тестирование на антитела к ВИЧ осуществляют с целью:
а) безопасности гемотрансфузий и трансплантаций;
б) эпиднадзора, тестирование в целях мониторинга превалентности ВИЧ-инфекции и изучения динамики ее распространенности в определенной популяции;
в) диагностики ВИЧ-инфекции, т. е. добровольное тестирование сыворотки крови практически здоровых людей или больных с различными клиническими признаками и симптомами, сходными с ВИЧ-инфекцией или СПИДом.
Система проведения лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции построена по трехэтапному принципу. Первый этап - скрининговый, предназначен для выполнения первичных исследований крови на наличие антител к белкам ВИЧ. Второй этап референтный - позволяет с помощью специальных методических приемов уточнить (подтвердить) первичный положительный результат, полученный на скрининговом этапе. Третий этан - экспертный, предназначен для окончательной проверки наличия и специфичности маркеров ВИЧ-инфекции, выявленных на предыдущих этапах лабораторной диагностики. Необходимость нескольких этапов лабораторной диагностики обусловлена прежде всего экономическими соображениями.
В практике применяется несколько тестов, позволяющих с достаточной степенью достоверности выявлять ВИЧ-инфицированных:
ИФА (ELISA)-тecт (твердофазный иммуноферментный анализ) выявления первого уровня, характеризуется большой чувствительностью, хотя и меньшей специфичностью перед нижеследующими;
Иммунный блот (Western-blot), весьма специфичный и наиболее используемый тест, позволяющий дифференцировать ВИЧ-1 и ВИЧ - 2;
Антигенемия р25-тест, эффективный в начальных стадиях заражения;
Полимеразная цепная реакция (ПЦР).
В случаях массового скрининга образцов крови рекомендуется тестировать смеси сывороток от группы обследуемых, составленные с таким расчетом, чтобы конечное разведение каждого образца не превышало 1:100. Если смесь сыворо-ток оказывается положительной, проводится исследование каждой сыворотки положительной смеси. Этот способ не ведет к потере чувствительности как в ИФА, так и в иммуноблоте, но снижает трудовые затраты и стоимость первичного обследования на 60-80%.
При первичной серодиагностике ВИЧ-инфекции проводится определение суммарных антител с помощью скрининговых отборочных тестов - ИФА и агглютинационных реакций. На втором (арбитражном) этапе используют более сложный тест - иммуноблот, позволяющий не только подтвердить или отклонить первоначальное заключение, но и сделать это на уровне определения антител к индивидуальным белкам вируса.
Иммуноферментный анализ (ИФА) является основным и наиболее широко применяемым методом определения антител к ВИЧ. Но к недостаткам применения ИФА в серодиагностике ВИЧ-инфекции следует отнести частые ложноположительные результаты. В связи с этим результат в ИФА не является основанием для заключения о ВИЧ-серопозитивности обследуемого. Это связано с недостаточной очисткой иммуносорбента от балластных белков; спонтанным связыванием антител сыворотки с пластиком, если его участки, не занятые иммуносорбентом, недостаточно блокированы или не блокированы совсем специальным нейтральным белком; перекрестным взаимодействием с ВИЧ-белками иммуносорбента различных протеинов, присутствующих в крови лиц с определенными, чаще аутоиммунными патологическими процессами типа рассеянного склероза, СКВ, туберкулеза; с частым донорством, инфекционными и онкозаболеваниями, ожогами, беременностью, повторными гемотрансфузиями, пересадкой органов, тканей, а также лиц, находящихся на гемодиализе; с присутствием в крови ревматоидного фактора, часто провоцирующего ВИЧ-ложноположительные реакции; наличием в крови обследуемых людей антител к gag-белкам ВИЧ и прежде всего к белку р24 (очевидно, образуются антитела к экзо-или эндогенным не идентифицированным еще ретровирусам). Так как анти-р24 синтезируются в обязательном порядке на ранних стадиях ВИЧ-сероконверсии, проводится дальнейшее иммунологическое наблюдение за лицами с антителами к gag-белкам ВИЧ, а также отстранение их от донорства.
Чувствительность и специфичность иммуноферментно-го анализа постоянно повышаются. В результате ИФА четвертого поколения не уступают по своим диагностическим возможностям иммунному блотингу и могут быть использованы не только на скрининговом, но и на подтверждающем этапе диагностики ВИЧ-инфекции [Смольская Т. Т., 1997].
Иммуноблотинг является конечным методом серологической диагностики, позволяющим сделать окончательное заключение о ВИЧ-позитивности или негативности обследуемого.
Существует четкая корреляция между результатами исследования сывороток в иммуноблоте и ИФА - дважды положительные в ИФА с разными тест-системами сыворотки в 97-98% случаев оказываются затем ВИЧ-позитивными в иммуноблотинге. Если же сыворотки оказались положительными в ИФА лишь в одной из двух использованных тест-систем, в иммуноблоте они выявляются положительными лишь в 4% случаев. В 5% случаев при проведении подтверждающих исследований у лиц с положительными данными ИФА-иммуноблот может давать «неопределенные» результаты, а среди них примерно в 20% случаев «неопределенные» результаты вызывают антитела к gag-белкам ВИЧ-1 (р55, р25, р18). Наличие антител только к gag-белкам ВИЧ-1 является поводом для дополнительного обследования сыворотки крови на инфицирование ВИЧ-2.
Оценка результатов иммуноблотинга осуществляется строго в соответствии с прилагаемой к тест-системе инструкцией. В случае отсутствия в инструкции указаний по интерпретации результатов следует использовать критерии ВОЗ.
При получении положительных результатов исследований на референтном этапе лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции и отрицательном результате исследования методом иммунного блотинга проводится обязательная повторная экспертная диагностика через 6 мес после первого обследования.
Если результаты иммуноблотинга через 12 мес после исследования первой пробы остаются отрицательными или неопределенными, то при отсутствии факторов риска, клинических симптомов или других факторов, связанных с ВИЧ-инфицированием, обследуемого снимают с диспансерного наблюдения.
Среди серологических методов в случае неопределенных результатов иммуноблота используется в качестве экспертной диагностики радиоиммунопреципитация (РИП). В основе ее лежит использование белков вируса, меченных радиоактивным йодом, а преципитаты выявляются с помощью бета-счетчиков. К недостаткам метода относится дороговизна аппаратуры, необходимость оборудования для этих целей специальных помещений.
Лица, у которых диагностирована ВИЧ-инфекция, подлежат постоянному динамическому наблюдению с обязательным лабораторным обследованием каждые 6 мес.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) выявляет предварительно умноженные нуклеотидные последовательнос-ти, специфичные для генома данного возбудителя. Изолированное умножение гена или его фрагмента, называемое амплификацией, ПЦР дает возможность осуществлять в пробирке при помощи фермента термостабильной ДНК-полимеразы. За 2-3 часа ПЦР позволяет получить миллионы копий специфического участка вируса. При ВИЧ-инфекции из клеточной РНК, включающей и РНК вируса, если он репродуцировался в клетке или был интегрирован в ее геном, с помощью обратной транскрипции и гибридизации с мечеными олигонуклеотидными «зондами» получают достаточное для анализа количество провирусной ДНК, которую выявляют и характеризуют количественно, как и в отношении принадлежности к геному ВИЧ, по радиоактивной или иной метке зонда устанавливая гомологию ДНК и специфических для вируса аминокислотных последовательностей. Чувствительность ПЦР - обнаружение вирусных генов в одной из пяти тысяч клеток.
ПЦР, в том числе количественная, может быть исполь-зовна только в целях определения вирусной нагрузки на плазму для решения вопроса начала медикаментозного лечения больного или смены антиретровирусных лекарственных препаратов. ПЦР не может быть рекомендована для постановки диагноза ВИЧ-инфекции, так как даже самые ультрасовременные методы ее постановки и реактивы позволяют определить вирусную нагрузку не ниже определенного уровня - 50 копий/мл. А сложность постановки ПЦР и ее дороговизна (около 200 долларов) сводят на нет ее широкомасштабное использование как метода повседневной лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции. Таким образом, ПЦР остается незаменимой только для оценки вирусной нагрузки на плазму у больных с уже установленным диагнозом ВИЧ-инфекции в целях решения вопроса терапии больных.
Схематично этапы лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции представлены на рис. 1.
Рис. 1. Этапы лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции
В течение ВИЧ-инфекции существует период «темного лабораторного окна», когда количество антител против ВИЧ является недостаточным для чувствительности тест-систем. Период этот колеблется от одной недели до трех месяцев от момента заражения ВИЧ в зависимости от уровня чувствительности тест-системы. С учетом этого явления возникают сложности при обследовании донорской крови от лиц, пребывающих в упомянутом периоде ВИЧ-инфицирования. Поэтому в большинстве стран мира введена система использования крови только после ее хранения на протяжении 3-6 мес с целью осуществления обязательного повторного обследования на ВИЧ-инфекцию доноров данных доз крови и ее компонентов.
Стадия первичных проявлений характеризуется активностью репликативного процесса. Возникающие виремия и антигенемия вызывают образование специфических антител класса IgM: анти-р24, aнти-gp41, aнти-gp120. Антиген р24 у части инфицированных может быть выявлен в крови методом ИФА уже через 2 нед после заражения и определяться до 8-н недели. Далее в клиническом течении ВИЧ-инфекции отмечается второй подъем содержания в крови белка р24, он приходится на период формирования стадии СПИД.
Появление полной сероконверсии, когда в периферической крови регистрируется высокий уровень специфических антител класса IgG к структурным белкам ВИЧ gp41, р24, gpl20, существенно облегчает диагностику ВИЧ-инфекции. Большинство коммерческих наборов рассчитано на индикацию именно таких антител.
Трудности с выявлением антител у больных ВИЧ-инфекцией могут возникнуть в периоды массивной виремии и антигенемии, когда имеющиеся специфические антитела в крови израсходованы на связывание вирусных частиц, и репликативный процесс опережает наработку новых противовирусных антител.
У лиц с исходно ослабленной иммунной системой виремия и антигенемия появляются раньше и сохраняются на высоком уровне до исхода заболевания. Вместе с тем у таких больных отмечается низкое содержание свободных антител к ВИЧ, обусловленное двумя причинами - недостаточной продукцией антител В-лимфоцитами и связыванием антителами вирионов и растворимых белков ВИЧ, поэтому для определения инфицированности требуются тест-системы с повышенной чувствительностью или модификации методов анализа, предусматривающие этап высвобождения антител из иммунных комплексов.
Несмотря на обилие специфических маркеров ВИЧ-инфекции, наиболее часто определяемым является наличие суммарных антител к белкам ВИЧ. Термин «суммарный» подразумевает присутствие двух классов антител (IgG и IgM) и широкий спектр антител к различным, в первую очередь к структурным, белкам ВИЧ.
Определение СD4-клеток. Основным клинико-лабораторным показателем диагностики стадии ВИЧ-инфекции, степени разрушения иммунной системы у больных в повседневной жизни стало определение содержания CD4+-лимфоцитов: уменьшение уровня ниже 200 клеток/мм3 является основным критерием постановки диагноза СПИД. Считается, что все ВИЧ-инфицированные лица с количеством CD4+-лимфоцитов 200 клеток/мм3 и ниже нуждаются как в противовирусной терапии, так и профилактике пневмоцистной пневмонии. И хотя у 1/3 ВИЧ-инфицированных с количеством С04+-лимфоцитов менее 200 клеток/мм3 отсутствуют клинические проявления, опыт показал, что у них симптомы развиваются в ближайшие 2 мес, поэтому они все расцениваются как больные на стадии СПИДа.
В настоящее время новые диагностические технологии позволяют выявить этиологические и патогенетические причины многих заболеваний и коренным образом повлиять на результаты лечения. Пожалуй, наиболее впечатляющие результаты внедрения этих технологий в клиническую практику достигнуты в области иммунологии и диагностики инфекционных заболеваний.
Тест-системы на основе иммуноферментного и иммунохемилюминесцентного анализа позволяют выявить антитела различных классов, что значительно повышает информативность методов клинической, аналитической чувствительности и специфичности для диагностики инфекционных заболеваний. Следует отметить, что наиболее значительные успехи в диагностике инфекций связаны с внедрением в лабораторную практику метода полимеразной цепной реакции, который считается «золотым стандартом» в диагностике и оценке эффективности проведенного лечения ряда инфекционных заболеваний.
Для исследования может быть использован различный биологический материал: сыворотка, плазма крови, соскоб, биоптат, плевральная или спинномозговая жидкость (СМЖ). В первую очередь, методы лабораторной диагностики инфекций направлены на выявление таких заболеваний, как вирусный гепатит В, С, D, цитомегаловирусная инфекция, инфекции, передающиеся половым путем (гонорейная, хламидийная, микоплазменная, уреаплазменная), туберкулез, ВИЧ-инфекция и др.
ВИЧ-инфекция - заболевание, вызываемое вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), длительное время персистирующего в лимфоцитах, макрофагах, клетках нервной ткани, в результате чего развивается медленно прогрессирующее поражение иммунной и нервной систем организма, проявляющееся вторичными инфекциями, опухолями, подострым энцефалитом и другими патологическими изменениями.
Возбудители инфекции - вирусы иммунодефицита человека 1-го и 2-го типов (ВИЧ-1, ВИЧ-2) - относятся к семейству ретровирусов, подсемейству медленных вирусов. Вирионы являются сферическими частицами диаметром 100-140 нм. Вирусная частица имеет наружную фосфолипидную оболочку, включающую гликопротеиды (структурные белки) с определенной молекулярной массой, измеряемой в килодальтонах. У ВИЧ-1 - это gpl60, gpl20, gp41. Внутренняя оболочка вируса, покрывающая ядро, также представлена белками с известной молекулярной массой - р17, р24, р55 (ВИЧ-2 содержит gpl40, gpl05, gp36, р16, р25, р55).
В состав генома ВИЧ входит РНК и фермент обратная транскриптаза (ревертаза). Для того чтобы геном ретровируса соединился с геномом клетки хозяина, вначале с помощью ревертазы происходит синтез ДНК на матрице вирусной РНК. Затем ДНК провируса встраивается в геном клетки-хозяина. ВИЧ обладает выраженной антигенной изменчивостью, значительно превышающей таковую у вируса гриппа.
В организме человека основной мишенью ВИЧ являются Т-лимфоциты, несущие на поверхности наибольшее количество СD4-рецепторов. После проникновения ВИЧ в клетку с помощью ревертазы по образцу своей РНК вирус синтезирует ДНК, которая встраивается в генетический аппарат клетки-хозяина (СD4-лимфоциты) и остается там пожизненно в состоянии провируса. Помимо Т-лимфоцитовхелперов поражаются макрофаги, В-лимфоциты, клетки нейроглии, слизистой оболочки кишечника и некоторые другие клетки. Причиной снижения количества Т-лимфоцитов (клетки CD4) является не только прямое цитопатическое действие вируса, но и их слияние с неинфицированными клетками. Наряду с поражением Т-лимфоцитов у больных с ВИЧ-инфекцией отмечается поликлональная активация B-лимфоцитов с увеличением синтеза иммуноглобулинов всех классов, особенно IgG и IgA, и последующим истощением этого отдела иммунной системы. Нарушение регуляции иммунных процессов проявляется также повышением уровня α-интерферона, β2-микроглобулина, снижением уровня IL-2. В результате нарушения функции иммунной системы, особенно при снижении числа Т- лимфоцитов (CD4) до 400 клеток в 1 мкл крови и менее, возникают условия для неконтролируемой репликации ВИЧ со значительным увеличением количества вирионов в различных средах организма. В результате поражения многих звеньев иммунной системы человек, зараженный ВИЧ, становится беззащитным перед возбудителями различных инфекций.
На фоне нарастающей иммунодепрессии развиваются тяжелые прогрессирующие заболевания, которые не встречаются у человека с нормально функционирующей иммунной системой. Это заболевания, которые Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) определила как СПИД-маркерные или СПИД-индикаторные заболевания.
СПИД-индикаторные заболевания
Первая группа - заболевания, присущие только тяжелому иммунодефициту (уровень СD4 <200). Клинический диагноз ставится при отсутствии анти-ВИЧ-антител или ВИЧ-антигенов.
Вторая группа - заболевания, которые могут развиваться как на фоне тяжелого иммунодефицита, так и в ряде случаев без него.
Поэтому в этих случаях необходимо лабораторное подтверждение диагноза.
Первая группа:
- кандидоз пищевода, трахеи, бронхов;
- внелегочный криптококкоз;
- криптоспоридиоз с диареей более 1 месяца;
- цитомегаловирусные поражения различных органов помимо печени, селезенки или лимфоузлов у больного в возрасте старше 1 месяца;
- инфекция, обусловленная вирусом простого герпеса, проявляющаяся язвами на коже и слизистой оболочке, которые персистируют более 1 месяца, а также бронхитом, пневмонией или эзофагитом любой продолжительности, поражающим больного в возрасте старше 1 месяца;
- генерализованная саркома Капоши у больных в возрасте до 60 лет;
- лимфома головного мозга (первичная) у больных в возрасте до 60 лет;
- лимфоцитарная интерстициальная пневмония и/или легочная лимфоидная дисплазия у детей в возрасте до 12 лет;
- диссеминированная инфекция, вызванная атипичными микобактериями (микобактерии комплекса М. aviumintracellulare) со внелегочной локализацией или локализацией (дополнительно к легким) в коже, шейных лимфатических узлах, лимфатических узлах корней легких;
- пневмоцистная пневмония;
- прогрессирующая многоочаговая лейкоэнцефалопатия;
- токсоплазмоз головного мозга у больных в возрасте старше 1 месяца.
Вторая группа:
- бактериальные инфекции, сочетанные или рецидивирующие, у детей в возрасте до 13 лет (более двух случаев за 2 года наблюдения): сепсис, пневмония, менингит, поражение костей или суставов, абсцессы, обусловленные гемофильными палочками, стрептококками;
- кокцидиоидомикоз диссеминированный (внелегочная локализация);
- ВИЧ-энцефалопатия (ВИЧ-деменция, СПИД-деменция);
- гистоплазмоз с диареей, персистирующей более 1 месяца;
- изоспороз с диареей, персистирующей более 1 месяца;
- саркома Капоши в любом возрасте;
- лимфома головного мозга (первичная) у лиц любого возраста;
- другие В-клеточные лимфомы (за исключением болезни Ходжкина) или лимфомы неизвестного иммунофенотипа: мелкоклеточные лимфомы (типа лимфомы Беркитта и др.); иммунобластные саркомы (лимфомы иммунобластные, крупноклеточные, диффузные гистиоцитарные, диффузные недифференцированные);
- микобактериоз диссеминированный (не туберкулез) с поражением помимо легких кожи, шейных или прикорневых лимфоузлов;
- туберкулез внелегочной (с поражением внутренних органов, помимо легких);
- сальмонеллезная септицемия, рецидивирующая;
- ВИЧ-дистрофия (истощение, резкое похудение).
В таблице 1 (см. ссылку на источник выше) приведены СПИД-индикаторные заболевания и их этиологические агенты.
Существует много классификаций СПИДа.
Согласно новой классификации, предложенной Центром по контролю за заболеваниями в США (табл. 2 - см. ссылку на источник выше), диагноз СПИДа устанавливается лицам, имеющим уровень CD4-лимфоцитов менее 200/мкл даже при отсутствии СПИД-индикаторных заболеваний.
Категория В включает различные синдромы, важнейшие из которых - бациллярный ангиоматоз, орофарингеальный кандидоз, рецидивирующий кандидозный вульвовагинит, трудно поддающийся терапии, цервикальная дисплазия, цервикальная карцинома, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, листериоз, периферическая нейропатия.
Антитела к ВИЧ-1 и ВИЧ-2 в крови
Антитела к ВИЧ-1 и ВИЧ-2 в сыворотке крови в норме отсутствуют.
Определение антител к ВИЧ является основным методом лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции. В основе метода лежит иммуноферментный анализ (ИФА) - чувствительность более 99,5%, специфичность - более 99,8%. Антитела к ВИЧ появляются у 90-95% инфицированных в течение 1 месяца после заражения, у 5-9% - через 6 месяцев, у 0,5-1% - в более поздние сроки. В стадии СПИДа число антител может снижаться вплоть до полного исчезновения.
Результат исследования выражается качественно: положительный или отрицательный.
Отрицательный результат исследования указывает на отсутствие антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-2 в сыворотке крови. Отрицательный результат лаборатория выдает сразу по его готовности. При получении положительного результата - выявлении антител к ВИЧ - во избежание ложноположительных результатов в лаборатории анализ повторяют еще 2 раза.
Иммуноблоттинг на антитела к вирусным белкам ВИЧ в сыворотке крови
Антитела к вирусным белкам ВИЧ в сыворотке крови в норме отсутствуют.
Метод ИФА по определению антител к ВИЧ является скрининговым. При получении положительного результата для подтверждения его специфичности используется метод иммуноблоттинга - Western-blot - встречная преципитация в геле антител в сыворотке крови больного с различными вирусными белками, подвергнутыми разделению по молекулярной массе с помощью электрофореза и нанесенными на нитроцеллюлозу. Определяются антитела к вирусным белкам gp41, gpl20, gpl60, р24, pi8, р17 и др.
Согласно рекомендациям Российского центра по профилактике и борьбе со СПИДом обнаружение антител к одному из гликопротеидов gp41, gpl20, gpl60 - следует считать положительным результатом. В случае выявления антител к другим белкам вируса результат считается сомнительным, такого пациента следует обследовать дважды - через 3 и 6 месяцев.
Отсутствие антител к специфическим белкам ВИЧ означает, что иммуноферментный метод дал ложноположительный результат. Вместе с тем, в практической работе при оценке результатов метода иммуноблоттинга необходимо руководствоваться инструкцией, прилагаемой фирмой к используемому «Набору для иммуноблоттинга».
Метод иммуноблоттинга применяется для лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции.
Антиген р24 в сыворотке крови
Антиген р24 в сыворотке крови в норме отсутствует.
Антиген р24 представляет собой белок стенки нуклеотида ВИЧ. Стадия первичных проявлений после инфицирования ВИЧ является следствием начала репликативного процесса. Антиген р24 появляется в крови спустя 2 недели после инфицирования и может быть выявлен методом ИФА в период от 2 до 8 недель. Через 2 месяца от момента инфицирования антиген р24 исчезает из крови. В дальнейшем в клиническом течении ВИЧ-инфекции отмечается второй подъем содержания в крови белка р24. Он приходится на период формирования СПИДа. Существующие тест-системы ИФА для детекции антигена р24 используются для раннего обнаружения ВИЧ у доноров крови и детей, определения прогноза течения СПИДа и контроля проводимой терапии у больных СПИДом. ИФА обладает высокой аналитической чувствительностью, что позволяет обнаруживать антиген р24 ВИЧ-1 в сыворотке крови в концентрации 5-10 пкг/мл и ВИЧ-2 - менее 0,5 нг/мл, и специфичностью. Однако следует отметить, что уровень антигена р24 в крови подвержен индивидуальным вариациям, а это значит, что только 20-30% пациентов могут быть выявлены с помощью данного исследования в ранний период после инфицирования (Rose N.R. et al., 1997).
Антитела к антигену р24 классов IgM и IgG в крови появляются со 2-й недели, достигают пика в течение 2-4 недель и удерживаются на таком уровне различное время: антитела класса IgM - в течение нескольких месяцев, исчезая в течение одного года после инфицирования, а антитела IgG могут сохраняться годами.
Алгоритм диагностики ВИЧ-инфекции зависит от фазы заболевания и характеризуется изменением динамики детекционных антител различных классов (рис. 1, 2 - см. ссылку на источник выше).
Результат исследования выражается качественно - положительный или отрицательный. Отрицательный результат исследования указывает на отсутствие антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-2 и антигена р24 в сыворотке крови.
Отрицательный результат лаборатория выдает сразу по его готовности. При получении положительного результата - выявлении антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-2 и/или антигена р24 - во избежание ложноположительных результатов в лаборатории анализ повторяют еще 2 раза.
Вне зависимости от полученных результатов исследования проба крови пациента и результаты 3 исследований направляются лабораторией в региональный центр СПИДа для подтверждения положительного результата или верификации неопределенного результата. В таких случаях окончательный ответ по данному исследованию выдает региональный центр СПИДа.
Обнаружение ВИЧ методом полимеразной цепной реакции (качественно)
Обнаружение ВИЧ методом полимеразной цепной реакции - ПЦР (качественно) проводится с целью:
- разрешения сомнительных результатов иммуноблоттингового исследования;
- для ранней диагностики инфицирования ВИЧ;
- контроля эффективности противовирусного лечения;
- определения стадии заболевания СПИДом (переход инфицированности в заболевание).
При первичном инфицировании ВИЧ метод ПЦР позволяет выявить РНК ВИЧ в крови уже спустя 10-14 суток после инфицирования.
Результат исследования выражается качественно: положительный или отрицательный. Отрицательный результат исследования указывает на отсутствие РНК ВИЧ в крови.
Положительный результат - выявление РНК ВИЧ - свидетельствует об инфицировании пациента.
Обнаружение ВИЧ методом полимеразной цепной реакции (количественно)
ВИЧ в крови в норме отсутствует.
Прямое количественное определение РНК ВИЧ с помощью ПЦР позволяет более точно, чем определение содержания клеток CD4, предсказать скорость развития СПИДа у лиц, инфицированных ВИЧ, следовательно - более точно оценить их выживаемость. Высокое содержание вирусных частиц обычно коррелирует с выраженным нарушением иммунного статуса и низким содержанием клеток CD4. Низкое содержание вирусных частиц обычно коррелирует с более благополучным иммунным статусом и более высоким содержанием клеток CD4. Содержание вирусной РНК в крови позволяет предсказать переход заболевания в клиническую стадию. При содержании РНК-1 ВИЧ >74 100 копий/мл почти у всех пациентов развивается клиническая картина СПИДа (Senior D., Holden Е., 1996).
Вероятность развития СПИДа в 10,8 раз выше у лиц с содержанием ВИЧ-1 в крови >10 000 копий/мл, чем у лиц с содержанием ВИЧ-1 в крови <10 000 копий/мл. При ВИЧ-инфекции прогноз непосредственно определяется уровнем виремии. Снижение уровня виремии при лечении улучшает прогноз заболевания.
Группой экспертов США разработаны показания для терапии пациентов с ВИЧ. Лечение показано пациентам с количеством клеток CD4 в крови <300/мкл или уровнем РНК ВИЧ в сыворотке >20 000 копий/мл (ПЦР). Оценка результатов антиретровирусной терапии у лиц, инфицированных ВИЧ, проводится по снижению уровня сывороточной РНК ВИЧ.
При эффективном лечении уровень виремии должен снижаться в 10 раз в течение первых 8 недель и быть ниже предела чувствительности метода (ПЦР) (<500 копий/мл) через 4-6 месяцев после начала терапии.
Таким образом, на сегодняшний день в клиническую практику для диагностики ВИЧ-инфекции внедрены и используются множество методов исследования, как и для всех других вирусных инфекций. Среди них ведущая роль отводится серологическим исследованиям. Основные методы диагностики ВИЧ-инфекций представлены в таблице 3 (см. ссылку на источник выше), где они разделены в зависимости от важности каждого метода для выявления вирусов на четыре уровня:
- А - тест обычно используется для подтверждения диагноза;
- В - тест полезен в определенных обстоятельствах для диагностики отдельных форм инфекции;
- С - тест редко используется для целей диагностики, но имеет большое значение для эпидемиологических обследований;
- D - тест обычно не используется лабораториями в диагностических целях.
Поскольку для диагностики вирусных инфекций помимо выбора оптимального метода анализа не менее важно правильное определение и взятие биоматериала для исследования, в таблице 4 (см. ссылку на источник выше) приведены рекомендации по выбору оптимального биоматериала для исследования ВИЧ-инфекции.
Для мониторинга ВИЧ-инфицированных следует использовать возможности комплексного исследования иммунного статуса - количественное и функциональное определение всех его звеньев: гуморального, клеточного иммунитета и неспецифической резистентности в целом.
В современных лабораторных условиях многоэтапный принцип оценки иммунологического статуса включает определение субпопуляции лимфоцитов, иммуноглобулинов крови. При оценке показателей следует учитывать, что для ВИЧ-инфекции характерно снижение соотношения CD4/CD8 Т-клеток меньше 1. Индекс CD4/CD8 1,5-2,5 -указывает на нормергическое состояние, более 2,5 - указывает на гиперактивность, менее 1,0 - свидетельствует об иммунодефиците. Также соотношение CD4/CD8 может быть меньше 1 при тяжелом течении воспалительного процесса.
Принципиальное значение это соотношение имеет при оценке иммунной системы у больных СПИДом, потому что ВИЧ избирательно поражает и разрушает СD4-лимфоциты, в результате чего соотношение CD4/CD8 понижается до значений, значительно меньше 1.
Оценка иммунологического статуса опирается также на выявление общих или «грубых» дефектов в системе клеточного и гуморального звена иммунитета: гипергаммаглобулинемия (повышение концентрации IgA, IgM, IgG) или гипогаммаглобулинемия в терминальной стадии; увеличение концентрации циркулирующих иммунных комплексов; снижение продукции цитокинов; ослабление ответа лимфоцитов на антигены и митогены.
Нарушение соотношения популяций в общем пуле В-лимфоцитов характерно для недостаточности гуморального иммунитета. Однако эти изменения неспецифичны для ВИЧ-инфекции и могут возникать и при других заболеваниях. В комплексной оценке ряда других лабораторных показателей следует учитывать, что для ВИЧ-инфекции характерны также: анемия, лимфо- и лейкопения, тромбоцитопения, повышение уровня β2-микроглобулина и С-реактивного протеина, повышение активности трансаминаз в сыворотке крови.
Клинико-лабораторная диагностика ВИЧ-инфекции имеет три направления:
- Установление факта инфицированностм ВИЧ, диагноза ВИЧ-инфекции.
- Определение стадии клинического течения болезни и выявление вторичных заболеваний.
- Прогноз прогрессии клинического течения заболевания, лабораторный контроль эффективности проводимого лечения и побочных эффектов антиретровирусных препаратов.
1. Установление инфицированности ВИЧ, диагноза ВИЧ-инфекции
Для определения ВИЧ-инфицированности используют следующие специфические показатели: антитела к ВИЧ, антигены ВИЧ, РНК ВИЧ и ДНК провируса. Антитела к ВИЧ определяются методом иммуноферментного анализа (ИФА) или иммуноблотинга, являющегося по сути разновидностью ИФА. Антигены (белки) ВИЧ определяются методом ИФА. С помощью молекулярно-генетических методов полимеразной цепной реакции (ПНР) и bДНК можно определять РНК ВИЧ и ДНК провируса. Применение дополнительно метода гибридизации нуклеиновых кислот со специфическими ДНК-зондами позволяет проверить специфичность последовательностей ДНК, полученных при проведении ПЦР. Чувствительность ПЦР - обнаружение вирусных генов в одной из пяти тысяч клеток .
При первичной инфекции наблюдается следующая динамика маркеров ВИЧ в крови инфицированных. В первый месяц в результате активации репликативного процесса происходит резкое увеличение вирусной нагрузки (содержание РНК ВИЧ в плазме), затем, вследствие диссеминации вируса и массового инфицирования клеток-мишеней в крови и лимфатических узлах, становится возможным определение провирусной ДНК. Первостепенную диагностическую ценность имеет факт выявления ДНК провируса, интегрированной в геном клетки-мишени.
Вирусная нагрузка отражает интенсивность репликативного процесса в инфицированных клетках. В период первичной инфекции уровень вирусной нагрузки различен при инфицировании разными субтипами ВИЧ, однако динамика его изменений примерно одинакова. Так, при инфицировании субтипом В, например, если в первый месяц после заражения значение вирусной нагрузки составляет 700 копий/мл, то во 2-й месяц происходит снижение до 600, в 3-й - до 100, в 4-й - до 50 копий/мл. Такая динамика наблюдается на фоне нарастания содержания в крови специфических антител к ВИЧ. Содержание провирусной ДНК в мононуклеарах крови ВИЧ-инфицированных характеризуется относительным постоянством в течение первых 6 мес с незначительными флюктуациями у некоторых субтипов. Таким образом РНК- и ДНК-нагрузки не являются тождественными.
В стадии инкубации в течение некоторого времени не происходит образования специфических антител к ВИЧ в количестве, достаточном для определения существующими лабораторными методами. До регистрации антител в течение очень короткого времени наблюдается появление в крови белка Nef, которым репрессирует репликативный процесс, и структурного белка р24. Антиген р24 может быть выявлен в крови методом иммупоферментного анализа уже через 1-2 пед после заражения и определяться до 8-й нед, затем его содержание резко снижается. Далее в клиническом течении ВИЧ-инфекции отмечается второй подъем содержания в крови белка р24. Он приходится на период формирования СПИД. Исчезновение в крови свободных (не связанных антителами) сердцевинных белков р24 и появление специфических антител к белкам ВИЧ знаменуют наступление сероконверсии (рис. 9.6).
Виремия и антигенемия вызывают образование специфических антител класса IgM (анти-р24, анти-gр41, анти-gр120, анти-gр160). Свободные антитела классов IgM и IgG к белку р24 могут появиться, начиная со 2-й нед, их содержание повышается в течение 2-4 нед, достигая определенного уровня, на котором сохраняется в течение месяцев (IgM) и лет (IgG) (рис. 9.7).
Появление полной сероконверсии, когда в периферической крови регистрируется высокий уровень специфических антител класса IgG к структурным белкам ВИЧ р24, gp41, gp120, gр160, существенно облегчает диагностику ВИЧ-инфекции. Антитела к ВИЧ появляются у 90-95% инфицированных в течение 3-х мес после заражения, у 5-9% - в период от 3 до 6 мес от момента заражения и у 0,5-1% - в более поздние сроки.
Не смотря на то, что антитела к ВИЧ появляются в последнюю очередь, основным лабораторным диагностическим показателем до настоящего времени является выявление специфических антител методом ИФА и иммуноблотинга.
Данные, представленные в табл.9.2 [показать] и 9.3 [показать] , наглядно демонстрируют высокую чувствительность современных иммуноферментпых тест-систем при определении антител к ВИЧ, превосходящую чувствительность иммуноблотинга. В некоторых случаях при получении первичного положительного результата в ИФА подтвердить его в иммуноблотинге можно только через 2-3 нед.
| Таблица 9.3. Пример мониторинга сероконверсии (по Н.Fleury, 2000) | |||||
| Момент определения | Антиген р24, пг/мл | Антитела к белкам ВИЧ | |||
| ИФА, ОП обр /ОП кр ** | Иммуноблотинг | ||||
| HIV DUO | Gen-screen | Uniform | |||
| Пациент 1 | |||||
| Первично | 17 | 1,24 | меньше 1 | меньше 1 | * |
| Через 4 дня | 67 | 1,36 | 1,85 | меньше 1 | - |
| Через 7 дней | * | 2,33 | 6,84 | меньше 1 | - |
| Через 2 дня | * | 6,77 | 15,0 | 4,8 | gp160 |
| Пациент 2 | |||||
| Первично | 400 | 13 | меньше 1 | меньше 1 | - |
| Через 5 дней | 450 | 18 | 2,11 | меньше 1 | - |
| Через 10 дней | * | 33 | 12,19 | 2,9 | gp160 |
| Примечание: * - определение не проводились
** - отношение оптической плотности исследуемого образца сывороткм к критическому (пороговому) значению оптической плотности |
|||||
При обследовании больных ВИЧ-инфекцией (ВИЧ-инфицированных) с использованием тест-систем иммуноблотинга ведущих фирм мира во всех случаях выявляются антитела к gp160 и р24/25, к другим белкам антитела обнаруживают в 38,8-93,3% случаев (табл. 9.4 [показать] ).
Трудности с выявлением антител у больных ВИЧ-инфекцией могут возникнуть в периоды массивной виремии и антигенемии, когда имеющиеся специфические антитела в крови связаны с вирусными частицами, и репликативный процесс опережает наработку новых противовирусных антител. Такая ситуация может возникать и исчезать в течение инфекционного процесса .
У пациентов с исходно ослабленной иммунной системой виремия и антигенемия появляются раньше и сохраняются на высоком уровне до исхода заболевания. У таких больных отмечается низкое содержание свободных антител к ВИЧ, обусловленное двумя причинами - недостаточной продукцией антител В-лимфоцитами и связыванием антител вирионами и растворимыми белками ВИЧ, поэтому для определения инфицированности требуются тест-системы с повышенной чувствительностью или модификации методов анализа, предусматривающие этап высвобождения антител из иммунных комплексов .
Наиболее часто снижение содержания антител к ВИЧ по указанным причинам происходит в терминальной стадии, когда антитела к ВИЧ в сыворотке кроим могут не улавливаться не с помощью методов иммуноферментного анализа, ни метода иммумоблотинга (Western blot). Кроме появления специфических антител к ВИЧ иммунный ответ в первые 4 мес характеризуется снижением содержания в крови инфицированного CD4+- и увеличением СD8+-клеток. Далее содержание клеток, несущих рецепторы СD4 и СD8, стабилизируется и остается неизменным в течение некоторого времени. Увеличение содержания СD8-лимфоцитов является защитной реакцией, т.к. клеточнозависимая цптотоксичность реализуется СD8+-лимфоцитами, которые направлены на уничтожение ВПЧ-инфицированных клеток. Вначале цитотоксические лимфоциты (ЦТЛ) реагируют на регуляторный белок Nef вируса, что играет важную роль в снижении вирусной (РНК) нагрузки в плазме ВИЧ-инфицированного в первые месяцы. Затем формируется ответ ЦТЛ и к другим, в т.ч. структурным, белкам ВИЧ, в результате чего через 12 мес после заражения цптотоксический эффект значительно возрастает.
Схемы лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции
С учетом приведенной динамики специфических маркеров ВИЧ-инфекции на практике целесообразно придерживаться следующих схем лабораторной диагностики у взрослых (рис. 9.8-9.10).
На схемах отражены три основных этапа первичной лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции:
- Скрининговый.
- Референтный.
- Экспертный.
Необходимость нескольких этапов лабораторной диагностики обусловлена прежде всего экономическими соображениями. Так, например, стоимость проведения с помощью отечественных тест-систем одного экспертного исследования методом иммуноблотинг составляет до 40 долларов США, скринингового (методом ИФА) - около 0,2, то есть соотношение составляет 1:200.
На первом этапе (рис. 9.8) у обследуемых проводится определение антител к ВИЧ с помощью одной иммуноферментной тест-системы, предназначенной для детекции антител к обоим типам вируса - ВИЧ-1 и ВИЧ-2.
Фирмами-производителями в предлагаемых тест-системах в качестве антигенной основы используются вирусный лизат, рекомбинантные белки, синтетические пептиды. Каждый из перечисленных носителей антигенных детерминант ВИЧ обладает своими достоинствами и недостатками. Поэтому при выборе тест-систем приблизительно равной стоимости следует предпочитать наборы с наибольшей чувствительностью (желательно 100%). Среди тест-систем одинаковой стоимости и чувствительности целесообразно остановиться на имеющих максимальную специфичность.
На основе лизата вируса были созданы первые тест-системы для лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции. В 80-х годах такие тест-системы характеризовались чувствительностью менее 100% и низкой специфичностью, проявляющейся большим количеством (до 60%) ложноположительных результатов.
При формировании вириона в культуре лимфоцитов его оболочка создается из наружной мембраны и поэтому содержит антигены главного комплекса гистосовместимости I и II классов. Это обстоятельство обусловливает ложно-положительные реакции в том случае, если в крови пациентов присутствуют антитела к аллоантигенам гистосовместимости.
Позднее для получения вируса было предложено использовать культуру макрофагов, в которых вирусные частицы формируются преимущественно внутриклеточно путем почкования не от наружной мембраны клетки, а от мембран эндоплазматического ретикулума. Такая технология позволила снизить количество ложноположительных результатов.
Одними из лучших по самым важным характеристикам - чувствительности и специфичности - признаны иммуноферментные тест-системы, в составе которых использована комбинация очищенного вирусного лизата с синтетическими пептидами, представляющими собой наиболее антигензначимые участки белков вируса, или рекомбинантными белками.
Чувствительность тест-системы зависит также и от характеристик других компонентов наборов. Так, тест-системы, в которых использованы конъюгаты, распознающие антитела не только класса IgG, но и IgM, и IgА, позволяют выявлять более раннюю фазу сероконверсии. Перспективным представляется применение тест-систем, с помощью которых можно одновременно определять и противовирусные антитела, и антиген р24, что делает еще более ранней лабораторную диагностику ВИЧ-инфекции.
Первичный положительный результат необходимо перепроверять повторным исследованием образца в той же тест-системе, но желательно другой серии и другим лаборантом. Если при повторном исследовании получен отрицательный результат, исследование проводится третий раз.
После подтверждения положительного результата желательно осуществить повторное взятие крови и исследовать ее на антитела к ВИЧ как первичную. Повторное взятие крови позволяет предупредить ошибку, обусловленную неточностью маркировки пробирок и заполнения бланков направлений.
Серопозитивная на скрининговом этапе сыворотка крови направляется на референтные исследования, выполняемые с использованием двух-трех высокоспецифичных ИФА тест-систем. В случае двух положительных результатов проводят экспертное исследование методом иммуноблотинга.
Применение в референтной диагностике иммуноферментных тест-систем, с помощью которых можно дифференцировать специфические антитела к ВИЧ-1 и ВИЧ-2, облегчает дальнейшую работу и позволяет исследовать позитивный образец на экспертном этапе сразу с использованием соответствующего иммуноблотинга (ВИЧ-1 или ВИЧ-2).
Лабораторное экспертное заключение об инфицированности ВИЧ выносится только на основании положительного результата иммуноблотинга (Western blot). При проведении экспертной диагностики необходимо пользоваться предложенными в 1990 г. группой экспертов ВОЗ номенклатурой генов и генных продуктов ВИЧ (табл. 9.5 [показать] ).
Специфичность полос на иммуноблоте следует оценивать очень внимательно и тщательно, используя при этом результаты исследований контрольных сывороток (положительной и отрицательной), которые проводятся параллельно с исследованием опытных проб, и образец иммуноблота с обозначением белков ВИЧ (прилагается фирмой-производителем к тест-системе). Интерпретацию полученных результатов следует проводить согласно прилагаемой к тест-системе инструкции. Как правило, критерием позитивности является обязательное наличие антител к двум белкам (предшественнику, наружному или трансмембранному), кодируемым геном env, и возможное присутствие антител к продуктам двух других структурных генов ВИЧ - gag и pol (табл. 9.6 [показать] ).
| Таблица 9.6. Критерии интерпретации результатов иммуноблотинга для ВИЧ-1 и ВИЧ-2 (ВОЗ, 1990) | |||
| Результат | ВИЧ-1 | ВИЧ-2 | |
| Положительный | +/- полосы pol +/- полосы gag | 2 полосы env (предшественник, наружный gр или трансмембранный gp) +/- полосы pol +/- полосы gag |
|
| Отрицательный | Отсутствие ВИЧ-1 специфических полос | Отсутстпне ВИЧ-2 специфических полос | |
| Неопределенный | Другие профили, не рассматриваемые как позитивные или негативные | ||
В случае получения сомнительного результата необходимо пользоваться перечнем рекомендации для окончательного выяснения результатов иммуноблотинга (табл. 9.7 [показать] ).
| Таблица 9.7. Рекомендации для окончательного выяснения неопределенных результатов иммуноблотинга (ВОЗ, 1990) | |
| Наличие полос, соответствующих белкам ВИЧ | Интерпретация результата, дальнейшие действия |
| ВИЧ-1 | |
| Только р17 | |
| Только р24 и gp160 | Столь необычная картина может иметь место в начале сероконверсии. Следует провести немедленное повторное исследование образца. В случае получения того же профиля, необходимо через 2 нед после взятия 1-й пробы взять второй образец для тестирования в иммуноблотинге |
| Другие профили | Эти профили (gag и/или роl без env) могут свидетельствовать о сероконверсии или неспецифнческих реакциях |
| ВИЧ-2 | |
| Только р16 | Может классифицироваться как отрицательный, дополнительных определений не требует |
| I полоса env при наличии или отсутствии gag/роl | Следует провести повторное тестирование того же образца, но с использованием другой серии реагентов |
| Только р24 или gp140 | Этот необычный профиль может иметь место в начале сероконверсии. Следует провести немедленное повторное исследование образца. В случае получения того же профиля, через 2 нед после взятия 1-й пробы необходимо взять второй образец для тестирования в иммуноблотинге |
| Другие профили | Эти профили (gag и/или роl без env) могут свидетельствовать о сероконверсии или неспецифических реакциях. |
По рекомендациям Российского научно-методического центра по профилактике и борьбе со СПИД, положительным считается результат при наличии антител хотя бы к одному из белков gp41, gp120, gp160 в сочетании с антителами к другим специфическим белкам ВИЧ-1 или без них . Настоящие рекомендации сделаны па основании опыта работы с сыворотками детей из внутрибольничных очагов, у которых часто определялись антитела только к одному из белков оболочки вируса.
Основная часть первично обследованных серопозитивных в ИФА пациентов относится к фазе персистируюшей генерализованной лимфаденопатии (ПГЛ) или к бессимптомной фазе. Поэтому на иммуноблоте (нитроцеллюлозной полоске, на которой иммобилизованы белки ВИЧ) определяется, как правило, следующая комбинация антител к ВИЧ-1: антитела к оболочечным белкам gp160, gp120 и gp41, кодируемым геном env, в сочетании с антителами к сердцевинным белкам р24 (белок нуклеокапсида, кодируемый геном gag) и р31/34 (эндонуклеаза, кодируемая геном pol).
Положительные реакции только с белками gag и/или роl могут иметь место в случае ранней фазы сероконверсии, а также указывать на инфекцию, вызванную ВИЧ-2, или неспецифическую реакцию.
В случае получения сомнительного результата возможно использование различных методических приемов, позволяющих уточнить факт ВИЧ-инфекции.
В зависимости от технических возможностей (наличия диагностических наборов и реактивов, оснащенности специальной аппаратурой и подготовки персонала) экспертной лаборатории проводят дополнительные диагностические исследования (рис.9.10).
В ряде случаев целесообразно применение молекулярно-генетических методов, позволяющих определить генетические последовательности ВИЧ в сыворотке, в лимфоцитах крови или пунктатах лимфоузлов. Проверку специфичности последовательностей ДНК, полученных в результате ПЦР, можно провести методом гибридизации нуклеиновых кислот со специфическими ДНК-зондами.
Методы радиоиммунопреципитации (РИП) и непрямой иммунофлюоресценции (ИФл) могут быть также использованы для окончательной верификации сывороток с сомнительными результатами в иммуноблотинге .
Обнаружение РНК ВИЧ в плазме крови качественным или количественным методом не является значимым для диагностики инфекции ВИЧ. Такой результат должен быть подтвержден стандартными методами, такими как иммуноблотинг, через 2-4 мес после получения первичного сомнительного или отрицательного ответа.
Выделение ВИЧ в культуре клеток является истиной в последней инстанции. Однако метод сложен, дорог и выполняется только в специально оборудованных научно-исследовательских лабораториях.
Содержание СD4+ - клеток в крови является неспецифическим показателем, однако в спорных случаях (ИФА "+", иммуноблот "-", наличие клинических признаков ВИЧ-инфекции/СПИД) он может быть использован в качестве ориентира для принятия экспертного решения. Если же в лаборатории имеется возможность выполнения только иммуноблотинга, то следует придерживаться рекомендаций, изложенных в табл. 9.7 и на рис. 9.9.
Лица, при экспертном исследовании сыворотки которых получены сомнительные (неопределенные) результаты, за исключением случаев выявления антител только к р17 (ВИЧ-1) или р16 (ВИЧ-2), должны проходить повторное тестирование в течение 6 мес (через 3 мес). В случае истинной ВИЧ-инфекции по прошествии 3-6 мес в спектре антител наблюдают "положительную" динамику - дополнительное образование антител к другим белкам вируса. Ложная реакция характеризуется сохранением в течение длительного времени сомнительной картины иммунного блотинга или исчезновением подозрительных полос. Если по истечении указанного срока результаты повторного иммуноблотинга будут отрицательными или останутся сомнительными, то при отсутствии факторов риска, клинических симптомов или других факторов, связанных с ВИЧ-инфицированием, человек может считаться серонегативным в отношении антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-2.
Ложноположительные результаты, обусловленные содержанием в крови пациентов антител к аллоантигенам гистосовместимости, входящим в состав оболочки ВИЧ, проявляются на иммуноблоте в виде полос на уровне gp41 и gp31. Причины других неспецифических реакций (например, к р24, часто встречающейся у лиц с аутоиммунными процессами) пока не выяснены.
Совершенствование технологии производства иммунноферментных тест-систем позволило достичь высокой чувствительности - до 99,99%, в то время как чувствительность метода иммуноблотинга составляет 97%. Поэтому отрицательный резукльтат в иммуноблотинге при положительных результатах в ИФА может указывать на начальный период сероконверсии, характеризующийся низким уровнем специфических антител. Поэтому необходимо повторить исследование через 1,5-2 мес., то есть отрезок времени, необходимый для завершения сероконверсии, достижения в крови концентрации специфических антител, достаточной для выявления методом иммуноблотинга.
Положительный результат (результаты) исследования на референтном или только скрининговом этапе лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции, то есть положительный результат в какой-либо иммуноферментной тест-системе, в итоге не подтвержденный экспертными методами, интерпретируется как наличие в крови обследуемого антител перекрестного реагирования. Под перекрестным реагированием подразумевают связывание антителами неспецифических участков на белках или пептидах ВИЧ, используемых в качестве антигенной основы в той тест-системе, в которой получен положительный результат.
При отсутствии иммунодефицита и клинических признаков ВИЧ-инфекции такие лица считаются серонегативными в отношении антител к ВИЧ и должны быть сняты с учета.
Окончательный диагноз ВИЧ-инфекцин устанавливается только на основании всех клинических, эпидемиологических и лабораторных данных. Сообщить пациенту диагноз инфицированности ВИЧ имеет право только лечащий врач.
Основным методом подтверждающей (экспертной) лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции является иммуноблотинг. Однако, учитывая его более низкую по сравнению с ИФА чувствительность, рядом исследователей было предложено использование комбинации нескольких тест-систем для окончательного определения наличия специфических антител к ВИЧ. Так, например, G. van der Groen с соавт. предложили альтернативный иммуноблотингу способ проверки положительных результатов скринингового этапа лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции. Он предполагает исследование материала параллельно в трех тест-системах, которые основаны на различных методах детекции специфических антител к ВИЧ (несколько вариантов ИФА, реакция агглютинации) с использованием антигенов различной природы. Авторам удалось подобрать такие комбинации тест-систем, использование которых обеспечивает 100% чувствительность н специфичность при сравнении с результатами, полученными в иммуноблотинге.
Дешевизна такого метода экспертной диагностики является несомненным преимуществом, однако отсутствие информации, к каким конкретно белкам вируса имеются антитела в крови пациента, не позволяет оценивать специфичность реакции в каждом отдельном случае, а также отслеживать изменения спектра антител на ранней стадии сероконверсии.
Лабораторная диагностика ВИЧ-инфекции у детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей, имеет свои особенности . С момента рождения в течение длительного времени (до 15 мес) в крови таких детей могут циркулировать материнские антитела к ВИЧ. Через плацентарный барьер проникают только иммуноглобулины класса IgG, поэтому выявление у ребенка специфических к ВПЧ нммупоглобулинов классов IgМ и IgA позволяет подтвердить инфицированность, но отрицательный результат не может свидетельствовать об отсутствии ВИЧ.
У детей в возрасте до 1 мес репликации ВПЧ еще нет, и единственным методом верификации является ПЦР. Определение антигена р24 у детей старше 1 мес также является подтверждающим методом.
Отсутствие антител к ВИЧ у новорожденных не означает, что вирус не проник через плацентарный барьер. В любом случае дети ВИЧ-инфицированных матерей подлежат лабораторно-диагностическому обследованию и наблюдению в течение 36 мес от рождения .
Результаты лабораторных исследований на маркеры ВИЧ-инфекции требуют осторожной интерпретации и должны рассматриваться только в совокупности с данными эпидемиологического и клинического обследований. С другой стороны, следует заметить, что несмотря на высокую чувствительность современных методов, отрицательные результаты исследований не могут полностью исключить наличие ВИЧ-инфекции. Поэтому отрицательный результат исследования, например, методом иммуноблотинга, может быть сформулирован только как отсутствие специфических антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-2.
Диагностика ВИЧ-инфекции у серонегативных больных
Качество тест-систем, применяемых в лабораторной диагностике ВИЧ-инфекции, с каждым годом улучшается, повышается их чувствительность. Однако высокая изменчивость ВИЧ может привести к появлению новых типов, антитела к которым могут быть не распознаны существующими тест-системами. Кроме того, известны случаи атипичного гуморального ответа иммунной системы организма-хозяина на вирус. Так, L.Montagnier в 1996 г. сообщил о двух больных СПИД, у которых на протяжении предшествующих нескольких лет не были выявлены в крови специфические антитела, диагноз поставлен на основе клинических данных и подтвержден лабораторно только выделением ВПЧ-1 в культуре клеток. В таких случаях необходимо использовать рекомендации ВОЗ, согласно которым клиническая диагностика ВИЧ-инфекции у взрослых и детей возможна при наличии одного из 12 СПИД-индикаторных заболеваний:
- кандидоз пищевода, трахеи, бронхов, легких;
- внелегочной криптококкоз;
- криптоспоридиоз с диареей более одного мес;
- цитомегаловирусное поражение какого-либо органа (за исключением и помимо печени, селезенки и лимфатических узлов у больного старше 1 мес):
- инфекция, обусловленная вирусом простого герпеса, персистирующая более 1 мес у больного старше 1 мес;
- лимфома головного мозга у больного моложе 60 лет;
- лимфоцитарная интерстициальная пневмония у ребенка до 13 лет;
- диссиминированная инфекция, вызванная бактериями группы Micobacterium avium intracellulare или M.Kansassii;
- пневмоцистная пневмония;
- прогрессирующая многоочаговая лейко-энцефалопатия;
- токсоплазмоз центральной нервной системы у больных старше 1 мес.
Наличие одного из этих заболеваний позволяет диагностировать ВИЧ-инфекцию при отсутствии возможности проведения лабораторного исследования крови на наличие антител к ВИЧ или даже при получении серонегативного результата.
Источник : Медицинская лабораторная диагностика, программы и алгоритмы. Под ред. проф. Карпищенко А.И., СПб, Интермедика, 2001
Диагностика ВИЧ-инфекции включает в себя два этапа: установление собственно факта зараженности ВИЧ-инфекцией и определение стадии заболевания. За определением стадии неразрывно следует и выяснение характера течения заболевания, а затем и формирование прогноза у данного больного, а также выбор тактики лечения.
Как известно, диагностика любого инфекционного заболевания основана на сопоставлении эпидемиологических, клинических и лабораторных данных, и преувеличение значения одной из групп этих данных может привести к диагностическим ошибкам.
Эпидемиологические критерии ВИЧ-инфекции .
Первым этапом диагностики ВИЧ-инфекции является сбор эпидемиологического анамнеза и других эпидемиологических данных об обследуемом пациенте. Отсутствие эпидемиологических данных может существенно затруднить диагностику ВИЧ-инфекции и препятствовать проведению противоэпидемических мероприятий.
Эпидемиологические критерии иногда могут быть решающими в постановке диагноза ВИЧ-инфекции, но могут иметь и вспомогательное значение. Критерием высокой вероятности инфицирования является обнаружение у обследуемого лица таких факторов риска заражения, как переливание донорской крови, полученной от ВИЧ-инфицированного лица, рождение обследуемой женщиной ВИЧ-инфицированного ребенка. Велика вероятность инфицирования в случае рождения обследуемого от ВИЧ-инфицированной матери, полового контакта с ВИЧ-инфицированным лицом, совместного парентерального приема наркотиков с ВИЧ-инфицированным лицом. Определенный риск заражения обнаруживается при достоверных парентеральных вмешательствах, которые осуществляются инструментами, вероятно, контаминированными ВИЧ (то есть во внутрибольничных и подобных им очагах ВИЧ-инфекции с парентеральным путем передачи ВИЧ).
О заметном риске заражения речь может идти в тех случаях, когда обследуемый сообщает о половых связях или о парентеральном приеме наркотиков на территориях, где ВИЧ значительно распространен среди той группы населения, к которой принадлежит обследуемый.
В то же время половые связи и прием наркотиков на территориях с низким распространением ВИЧ-инфекции не исключает возможности заражения ВИЧ.
Отсутствие достоверных факторов риска заражения ВИЧ может ставить под сомнение данные лабораторных исследований. В таких случаях рекомендуется повторить лабораторные исследования.
Клинические критерии ВИЧ-инфекции.
Ранняя диагностика ВИЧ-инфекции обеспечивает своевременность терапии больного и развертывание профилактических мероприятий в очаге, предупреждающих неумышленную передачу вируса от инфицированного здоровому человеку. Наконец, ранняя диагностика позволяет своевременное проведение диспансеризации, психологической помощи, социальной реабилитации. Первые успехи в терапии больных позволяют при ранней диагностике значительно продлить жизнь больным и даже надеяться на излечение.
Сложность ранней диагностики, базирующейся на клинической картине заключается в неспецифичности, полиморфности симптоматики в стадии II, уже не говоря об отсутствии клиники в стадии I. Тем не менее во всех случаях немотивированной утомляемости, наличия ночных потов, головной боли, особенно на фоне кратковременной лихорадки (3-10 дней) с температурой 38-38,50 С, сопровождающейся тонзиллитом, длительного диарейного синдрома, похудания за короткое время, необходимо в первую очередь исключить ВИЧ-инфекцию. Постановке диагноза в этот период помогает выявление при объективном обследовании разнообразной кожной сыпи (пятна, папулы, розеолы, гнойнички) или фурункулеза. Наличие лимфаденопатии, даже в случаях увеличения одной группы лимфатических узлов и тем более при генерализованной уже с большей долей вероятности позволяет заподозрить клинически ВИЧ-инфекцию. Для болезни особенно характерно увеличение заднешейных, подчелюстных, над- и подключичных, подмышечных и локтевых лимфатических узлов. Как правило, они увеличиваются размером до 2-5 см в диаметре, безболезненны, плотно-эластичной консистенции, изредка сливаются в конгломерат. Весьма характерно для ВИЧ-инфекции увеличение более чем одного узла, более чем одной группы (за исключением паховых), длящееся свыше 3 мес.
Нередко в ранней фазе болезни наличие психо-неврологической симптоматики: чувство тревоги, депрессия, шаткость походки, снижение остроты зрения, судорожные припадки с признаками поражения психо-эмоциональной сферы (нарушение памяти, забывчивость, неадекватность поведения, притупление эмоций). К наиболее характерным признакам ранней стадии ВИЧ-инфекции относятся:
1. Снижение массы тела менее, чем на 10%;
2. Изменения на коже и слизистых оболочек (себорйный дерматит, фолликулит, пруриго, псориаз, грибковые поражения ногтей, рецидивирующие язвы в полости рта, некротический гингивит);
3 . Опоясывающий герпес у лиц моложе 50 лет;
4. Рецидивирующие инфекции верхних дыхательных путей;
В промежуточной стадии болезни, характеризующейся клиникой развернутой суперинфекции, сформировавшейся в результате иммунодефицита наиболее характерны:
1 . Прогрессирующее снижение массы тела свыше 10%;
2 . Диарея неясного генеза, продолжающаяся свыше 1 мес..;
3 . Кандидоз полости рта;
4 . Лейкоплакия;
5. Туберкулез легких;
6. Периферическая нейропатия;
7. Локализованные формы саркомы Капоши;
8. Диссеминирующий опоясывающий герпес;
9. Тяжелая, рецидивирующая бактериальная инфекция (пневмония, синуситы, пиомиозит).
Для поздней стадии , позволяющей диагностировать ВИЧ-инфекцию, или, во всяком случае, проводить дифференциальную диагностику, относятся:
1. Пневмоцистная пневмония;
2 . Токсоплазмоз;
3. Криптококкоз;
4. CMV-инфекция;
5. Простой герпес;
6. Прогрессирующая многоочаговая лейкоэнцефалопатия;
7. Гистоплазмоз;
8. Кандидозный эзофагит;
9. МАК-инфекция;
10. Сальмонеллезная септицемия;
11. Внелегочной туберкулез;
12. Лимфома, саркома Капоши;
13. Кахексия;
14. ВИЧ-энцефалопатия.
В 1988 ВОЗ предложила в целях клинической диагностики проводить балловую оценку симптомов , имеющихся у подозреваемого на ВИЧ-инфекцию больного:
Персистирующая генерализованная лимфаденопатия 0
Изменения на коже и слизистых оболочках 1
Снижение массы тела 1
Выраженная утомляемость 1
Простой герпес 2
Диарея длительностью свыше 1 мес. 4
Лихорадка длительностью свыше 1 мес. 4
Снижение массы тела свыше 10% 4
Туберкулез легких 5
Рецидивирующая бактериальная инфекция 5
Лейкоплакия полости рта 5
Стоматит, молочница рта 5
Локализованная саркома Капоши 8
Кахексия 12
При этом сумма баллов от 0 до 3 оценивается как вероятность ВИЧ-инфекции очень мала, 4 -11 баллов - заболевание вероятно, а 12 и свыше - очень вероятно.
В целом клиническая диагностика ВИЧ-инфекции – это, прежде всего диагностика спектра СПИД-ассоциированной патологии у больного вторичным иммунодефицитом. Так как ВИЧ-индикаторные заболевания включают 23 нозологические формы, наиболее целесообразен синдромальный подход к диагностике. Почти всегда имеет место у больного синдром общей интоксикации (немотивированная слабость, вялость, быстрая утомляемость) развивающийся на фоне длительного субфебрилитета или лихорадки неясного генеза, чаще в ночное и утреннее время, сопровождающейся обильным потом. Постоянен синдром немотивированной генерализованной периферической лимфаденопатии, в 20% сопровождающийся гепато- спленомегалией различной степени выраженности. Один из ведущих синдромов болезни - синдром бронхо-легочной патологии, правда глубокие поражения легочной ткани в виде пневмоцистной пневмонии развиваются в далеко зашедших случаях болезни, ибо развивается пневмоцистоз на фоне глубокого иммунодефицита. Зато длительностью свыше 1 месяца синдром немотивированной диареи относится к рано появляющимся, для него характерна устойчивость к медикаментозной терапии. Один из синдромов ВИЧ-инфекции - волнообразно текущая артралгия неясной этиологии. К характернейшим проявлениям болезни следует отнести и синдром поражений кожи и слизистых, проявляющийся неспецифической макуло-папулезной сыпью, устойчивой к терапии стероидами экземой, стафилококковым импетиго. К дерматологическим проявлениям также относятся рецидивирующие грибковые (микоз, кандидоз, бактериальные (фолликулиты, фурункулез, гидроаденит), вирусные (герпес) поражения кожи и слизистых оболочек. Наконец, ВИЧ-инфекцию характеризуют и новообразования, в основном в виде саркомы Капоши и лимфомы, а также некоторых других видов опухолей.
Наличие у пациента не менее двух клинических и двух клинико-лабораторных (лейко- лифо- нейтропения, гипогаммаглобулинемия) из числа вышеперечисленных симптомов позволяет с высокой степенью уверенности диагностировать ВИЧ-инфекцию. Но в то же время в случае выявления двух из таких весьма часто встречающихся у больных синдромов, как лихорадка и лимфаденопатия, сохраняющихся на протяжении месяца и свыше, стойкая немотивированная диарея, снижение массы тела более чем на 10% или обильные ночные поты дают основание на постановку диагноза и тщательного лабораторного обследования.
В стадии 2а заболевание можно заподозрить только по симптому персистирующей генерализованной лимфаденопатии у больного из группы риска или при наличии эпиданамнеза.
В стадии 2б (ранней или слабовыраженной) еще сохраняется соматическое благополучеие, нормальная активность. Поражения кожи и слизистых оболочек нетяжелые, рецидивирующие инфекции респираторного тракта не носят генерализованного характера, потеря массы тела не превышает 10%.
Согласно рекомендациям ВОЗ, надежная клиническая диагностика ВИЧ-инфекции у взрослых и детей возможна при наличии одного из 12 СПИД-индикаторных заболевания: 1) кандидоз пищевода, трахеи, бронхов, легких; 2) внелегочной криптококкоз; 3) криптоспоридиоз с диареей более одного месяца; 4) цитомегаловирусное поражение какого-либо органа (за исключением и помимо печени, селезенки и лимфатических узлов у больного старше 1 месяца); 5) инфекция, обусловленная вирусом простого герпеса, персистирующая более 1 месяца у больного старше 1 месяца; 6) саркома Капоши у больного моложе 60 лет; 7) лимфома головного мозга у больного моложе 60 лет; 8) лимфоцитарная интерстициальная пневмония у ребенка до 13 лет, 9) диссеминированная инфекция, вызванная бактериями группы Micobacterium avium intracellulare или M.Kansassii; 10) пневмоцистная пневмония; 11) прогрессирующая многоочаговая лейкоэнцефалопатия; 12) токсоплазмоз центральной нервной системы у больных старше 1 месяца. Наличие одного из этих заболеваний позволяет диагностировать ВИЧ-инфекцию при отсутствии серологического иммуноферментного исследования крови или даже при получении серонегативного результата.
Не менее сложна дифференсация фаз болезни, т.е. разграничение стадий по клиническим критериям. По мнению специалистов CDC (США) наиболее объективный критерий - количество Т-хелперов, а не клинические проявления, ибо многие из этих состояний часто встречаются у лиц, не инфицированных ВИЧ. В 1991 году Центр определил, что постановка диагноза СПИД может быть в случаях, если: а) у инфицированного имеется одно из 23 СПИД-ассоциированных состояний или б) он ВИЧ-инфицирован и имеет менее 200 СD4+ клеток/ мм.
Лабораторное критерии ВИЧ-инфекции.
Обследованию на ВИЧ-инфекцию в первую очередь подлежат:
2 . Лица с клиникой кандидозного эзофагита, кандидоза бронхов и легких, диссеминированного или внелегочного кокцидиомикоза, пневмоцистной пневмонии, внелегочного криптококкоза, криптоспоридиоза с диареей юлительностью свыше 1 мес., цитомегаловирусного поражения внутренних органов кроме печени, селезенки, лимфатических узлов у больных старше 6 мес., цитмегаловируснго ретинита с потерей зрения, герпетической инфекции с многоочаговыми язвами длительностью свыше 1 мес., бронхитом, пневмонией или эзофагитом, рецидивирующего опоясывающего герпеса, дессиминированного или внелегочного гистоплазмоза, туберкулеза легких или внелегочного, изоспориоза с диареей длительностью свыше 1 мес., распространенной или внелегочной МАК-инфекции, прогрессирующей многофокусной лейкоэнцефалопатии, токсоплазмоза мозга, сальмонеллезной септицемии, саркомы Капоши, лимфомы, лимфоидной интерстициальной пневмонии (у детей)
В настоящее время для лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции используются различные методы обнаружения ВИЧ, антигенов и генного материала ВИЧ, а также методы обнаружения антител к ВИЧ. Все эти методы обладают различной эффективностью, требуют различного оборудования и разного уровня подготовки персонала. Результаты этих исследований требуют грамотной интерпретации.
… диагностика любого инфекционного заболевания основана на сопоставлении эпидемиологических, клинических и лабораторных данных, и преувеличение значения одной из групп этих данных может привести к диагностическим ошибкам.
Диагностика ВИЧ-инфекции включает в себя два этапа
:
I
этап
- установление собственно факта зараженности ВИЧ-инфекцией
;
II
этап
- определение стадии заболевания
.
УСТАНОВЛЕНИЕ ФАКТА ЗАРАЖЕННОСТИ ВИЧ-ИНФЕКЦИЕЙ
Установление собственно факта зараженности ВИЧ-инфекцией (то есть выявление ВИЧ-инфицированных) в свою очередь также включает в себя два этапа
:
I этап
- иммуноферментный анализ
(ИФА)
: метод ИФА является скрининговым (отборочным) - отбор предположительно инфицированных лиц, то есть его целью является выявление подозрительных лиц и отсеивние здоровых лиц; антитела к ВИЧ выявляют с помощью других антител к искомым антителам (антитела против других антител). Эти «вспомогательные» антитела метят ферментом. Все скрининговые тесты обязаны быть высокочувствительными, чтобы не пропустить больного. Из-за этого их специфичность не очень высокая, то есть ИФА может дать положительный ответ («вероятно болен») у неинфицированных людей (например, у больных аутоиммунными заболеваниями: ревматизм, системная красная волчанка и др.). Частота ложноположительных результатов при использовании различных тест-систем колеблется от 0,02 до 0,5%. Если у человека ИФА дало положительный результат, то для подтверждения факта инфицирования ВИЧ необходимо обследоваться дальше. При проведении ИФА в 3 - 5% случаев возможны ложноотрицательные результаты - если инфицирование произошло относительно недавно и уровень антител еще очень низкий, или в терминальной стадии болезни, характеризующейся тяжелым поражением иммунной системы с глубоким нарушением процесса антителообразования. Поэтому при наличии данных, свидетельствующих о контакте с инфицированными ВИЧ обычно проводят повторные исследования через 2 - 3 месяца.
II этап
- иммуноблоттинг
(в модификации Western Blot, вестерн-блот)
: является более сложным методом и служит для подтверждения факта инфицирования. Этот метод выявляет не комплексные антитела к ВИЧ, а антитела к отдельным его структурным белкам (p24, gp120, gp41 и др.). Результаты иммуноблоттинга считаются положительными, если выявляются антитела хотя бы к трем белкам, один из которых кодируется генами env , другой - генами gag , третий - генами pol . Если обнаруживаются антитела к одному или двум белкам, результат считается сомнительным и требует подтверждения. В большинстве лабораторий диагноз ВИЧ-инфекции ставится, если одновременно выявляются антитела к белкам р24 , р31 , gp4l и gpl20/gp160. Суть метода: вирус разрушают на компоненты (антигены), которые состоят из ионизированных аминокислотных остатков, а потому все компоненты имеют отличающийся друг от друга заря; затем с помощью электрофореза (электрического тока) антигены распределяются на поверхности полоски - если в исследуемой сыворотке есть антитела к ВИЧ, то они будут взаимодействовать со всеми группами антигенов, а это можно выявить.
Следует помнить , что антитела к ВИЧ появляются у 90-95% инфицированных в течение 3-х месяцев после заражения, у 5-9% инфицированных антитела к ВИЧ появляются через 6 месяцев и у 0,5-1 % инфицированных антитела к ВИЧ появляются в более поздние сроки. В стадии СПИДа количество антител может снижаться, вплоть до полного исчезновения.
В иммунологии существует такое понятие, как «серологическое окно» - период от инфицирования до появления такого количества антител, которое можно выявить. Для ВИЧ этот период обычно продолжается от 2 до 12 недель, в редких случаях дольше. В период «серологического окна» по анализам человек здоров, но на самом деле является зараженным ВИЧ. Установлено, что ДНК ВИЧ может находиться в геноме человека не менее трех лет без признаков активности и антитела к ВИЧ (маркеры ВИЧ-инфицирования) не появляются.
В данный период («серологическое окно») выявить ВИЧ-инфицированного и даже через 1-2 недели после заражения возможно с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Это чрезвычайно чувствительный метод - теоретически можно выявить 1 ДНК на 10 мл среды. Суть метода заключается в следующем: с помощью полимеразной цепной реакции получают много копий нуклеиновой кислоты (вирус является нуклеиновой кислотой -ДНК или РНК - в белковой оболочке), которые потом выявляют с помощью меченых ферментов или изотопов, а также по характерному строению. ПЦР является дорогостоящим методом диагностики, поэтому при скрининге и в плановом порядке не используется.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТАДИИ ЗАБОЛЕВАНИЯ
В основе развития СПИДа лежит , в первую очередь, разрушение Т-лимфоцитов-хелперов, маркируемых моноклональными антителами - кластерами дифференцировки – как CD4. В связи с этим проведение диагностики и наблюдение за прогрессированием заболевания невозможно без контроля субпопуляции Т-хелперов, который наиболее удобно осуществлять с помощью лазерного клеточного сортировщика.
При слабо выраженной ВИЧ-инфекции количество Т-лимфоцитов - чрезвычайно вариабельный показатель. В целом, снижение числа клеток CD4 (абсолютное и относительное) обнаруживается у лиц, ВИЧ-инфицирование которых произошло не менее года назад. С другой стороны, на ранних стадиях инфекции нередко оказывается резко повышенным число Т-супрессоры (CD8) как в периферической крови, так и в увеличенных лимфоузлах.
При выраженном СПИДе абсолютное большинство больных имеет сниженное общее число Т-лимфоцитов (менее 1000 в 1 мкл крови, в том числе лимфоцитов CD4 - менее чем 22 в 1 мкл, тогда как абсолютное значение содержания CD8 остаётся в пределах нормы). Соответственно, резко снижается соотношение CD4/ CD8. Ответ Т-лимфоцитов in vitro на стандартные антигены и митогены снижается в строгом соответствии с относительно сниженным числом CD4.
Для поздних стадии СПИДа характерны общая лимфопения, нейтропения, тромбоцитопения (соответственно, снижение числа лимфоцитов, нейтрофилов и тромбоцитов), анемия. Эти изменения могут быть следствием центрального угнетения кроветворения за счёт поражения кроветворных органов вирусом, а также - аутоиммунного разрушения клеточных субпопуляции на периферии. Кроме того, для СПИДа характерно умеренное увеличение количества гамма-глобулинов с доминирующим увеличением содержания IgG. Больные с выраженными симптомами СПИДа нередко имеют повышенный уровень IgA. На некоторых стадиях заболевания существенно повышается уровень таких маркёров СПИДа, как 1-микроглобулин, кислотостабильный -интерферон, 1-тимозин. То же происходит с секрецией свободного неоптерина - метаболита макрофагов. Пока не представляется возможным оценить относительную значимость каждого из перечисленных тестов, число которых постоянно возрастает. Поэтому их следует рассматривать во взаимодействии с маркёрами ВИЧ-инфекции как иммуновирусологического, так и цитологического характера. Для клинического анализа крови характерны лейкопения, лимфопения (соответственно, снижение числа лейкоцитов и лимфоцитов).
1 стадия - «стадия инкубации
»
- антитела к ВИЧ еще не выявляются; диагноз ВИЧ-инфекции на данной стадии ставится на основании эпидемиологических данных и лабораторно должен подтверждаться обнаружением в сыворотке крови пациента вируса иммунодефицита человека, его антигенов, нуклеиновых кислот ВИЧ;
2 стадия - «стадия первичных проявлений
»
- в данном периоде уже имеется выработка антител:;
2А стадия - «бессимптомная
»
- ВИЧ-инфекция проявляется только выработкой антител;
2Б стадия - «острая ВИЧ-инфекция без вторичных заболеваний
»
- в крови больных могут обнаруживаться широкоплазменные лимфоциты - «мононуклеары» и часто отмечается транзиторное снижение уровня СD4-лимфоцитов (острая клиническая инфекция отмечается у 50-90% инфицированных лиц в первые 3 месяца после заражения; начало периода острой инфекции, как правило, опережает сероконверсию, т.е. появление антител к ВИЧ);
2В стадия - «острая ВИЧ-инфекция с вторичными заболеваниями
»
- на фоне снижения уровня СD4-лимфоцитов и развившегося вследствие этого иммунодефицита появляются вторичные заболевания различной этиологии (ангина, бактериальная и пневмоцистная пневмония, кандидозы, герпетическия инфекция и др.);
3 стадия - «латентная
»
- в ответ на прогрессирование иммунодефицита происходит модификация иммунного ответа в виде избыточного воспроизводства СD4-клеток с последующим постепенным снижением уровня СD4-лимфоцитов, в среднем со скоростью 0,05-0,07x109/л в год; в крови обнаруживаются антитела к ВИЧ;
4 стадия - «стадия вторичных заболеваний
»
- истощение лимфоцитов популяции CD4, концентрация антител к вирусу значительно снижается (в зависимости от тяжести вторичных заболеваний выделяют стадии 4А, 4Б, 4В);
5 стадия - «терминальная стадия
»
- типично снижение количества СD4-клеток ниже 0,05x109/л; концентрация антител к вирусу значительно снижается или антитела могут не определяться.