/ 16
Najslabše, najhujše najboljše
Na okužbo s HIV se testirajo:
2. Osebe s sumom ali potrjeno diagnozo: bakterijska okužba pri otrocih, mlajših od 13 let, večkratna in ponavljajoča se; kandidiaza požiralnika, sapnika, bronhijev ali pljuč; invazivni rak materničnega vratu; razširjena ali ekstrapulmonalna kokcidioidomikoza; zunajpljučna kriptokokoza; kriptosporidioza z drisko 1 mesec ali več; citomegalovirusne lezije drugih organov, razen jeter, vranice, bezgavk pri bolnikih, starejših od 1 meseca; citomegalovirusni retinitis z izgubo vida; herpetična okužba, ki povzroči multifokalne razjede, ki se ne zacelijo v 1 mesecu, ali bronhitis, pljučnica, ezofagitis; diseminirana ali ekstrapulmonalna histoplazmoza; izosporiaza z drisko, ki traja več kot 1 mesec; razširjena ali zunajpljučna tuberkuloza; pljučna tuberkuloza pri odraslih ali mladostnikih, starejših od 13 let; zunajpljučna tuberkuloza; druge bolezni, ki jih povzročajo mikobakterije, razen diseminirane ali zunajpljučne M. tuberculosis; pljučnica, ki jo povzroča pnevmocista; progresivna multifokalna levkoencefalopatija; salmonela (razen Salmonella typhi) septikemija, ponavljajoča se; možganska toksoilaza pri otrocih, starejših od 1 meseca; Kaposijevi sarkomi; limfoidna intersticijska pljučnica pri otrocih, mlajših od 13 let; Burkittov limfom; imunoblastični limfom; primarni možganski limfom; sindrom izčrpanosti, hepatitis B, prenašalstvo HBsAg; infekcijska mononukleoza; ponavljajoči se herpes zoster pri osebah, starejših od 60 let; spolno prenosljive bolezni.
V visoko specializiranem laboratoriju se izvajajo:
a) določanje protiteles, antigenov in imunskih kompleksov, ki krožijo v krvi; gojenje virusa, odkrivanje njegovega genomskega materiala in encimov;
b) ocena funkcij celične povezave imunskega sistema. Glavna vloga pripada metodam serološke diagnostike, katerih cilj je določanje protiteles, pa tudi antigenov patogenov v krvi in drugih telesnih tekočinah.
Testiranje na protitelesa proti HIV se izvaja z namenom:
a) varnost transfuzij in presaditev krvi;
b) nadzor, testiranje za spremljanje razširjenosti okužbe s HIV in proučevanje dinamike njene razširjenosti v določeni populaciji;
c) diagnosticiranje okužbe s HIV, to je prostovoljno testiranje krvnega seruma praktično zdravih ljudi ali bolnikov z različnimi kliničnimi znaki in simptomi, podobnimi okužbi s HIV ali aidsu.
Sistem za laboratorijsko diagnostiko okužbe s HIV temelji na tristopenjskem principu. Prva faza je presejanje, namenjeno opravljanju primarnih krvnih preiskav za prisotnost protiteles proti proteinom HIV. Druga stopnja je referenčna - omogoča uporabo posebnih metodoloških tehnik za razjasnitev (potrditev) primarnega pozitivnega rezultata, pridobljenega na stopnji presejanja. Tretja stopnja - ekspertna, je namenjena dokončnemu preverjanju prisotnosti in specifičnosti označevalcev okužbe s HIV, ugotovljenih v prejšnjih fazah laboratorijske diagnostike. Potreba po več stopnjah laboratorijske diagnostike je predvsem posledica ekonomskih razlogov.
V praksi se uporablja več testov za dovolj zanesljivo identifikacijo okuženih s HIV:
ELISA (ELISA) test (encimsko vezan imunski test) za odkrivanje prve stopnje je značilna visoka občutljivost, čeprav manj specifičnosti od naslednjih;
Imunski blot (Western-blot), zelo specifičen in najpogosteje uporabljen test za razlikovanje med HIV-1 in HIV-2;
Antigenemični p25-test, učinkovit v začetnih fazah okužbe;
Verižna reakcija s polimerazo (PCR).
V primerih množičnega presejanja vzorcev krvi je priporočljivo testirati mešanice serumov skupine preiskovancev, sestavljene tako, da končna razredčitev posameznega vzorca ne presega 1:100. Če je mešanica seruma in toka pozitivna, se testira vsak serum pozitivne mešanice. Ta metoda ne vodi do izgube občutljivosti tako pri ELISA kot pri imunoblotu, vendar zmanjša stroške dela in stroške začetnega pregleda za 60-80%.
Pri primarni serodiagnozi okužbe s HIV določimo skupna protitelesa s presejalnimi presejalnimi testi - ELISA in aglutinacijskimi reakcijami. Na drugi (arbitražni) stopnji se uporablja bolj zapleten test - imunoblot, ki omogoča ne le potrditev ali zavrnitev prvotnega zaključka, temveč tudi to na ravni določanja protiteles proti posameznim beljakovinam virusa.
Povezani imunosorbentni test(ELISA) je glavna in najbolj razširjena metoda za določanje protiteles proti HIV. Toda slabosti uporabe ELISA pri serodiagnozi okužbe s HIV vključujejo pogoste lažno pozitivne rezultate. V zvezi s tem rezultat testa ELISA ni podlaga za sklepanje, da je oseba HIV seropozitivna. To je posledica nezadostnega čiščenja imunosorbenta iz balastnih beljakovin; spontana vezava serumskih protiteles na plastiko, če njena področja, ki jih ne zaseda imunosorbent, niso dovolj blokirana ali niso blokirana s popolnoma posebnim nevtralnim proteinom; navzkrižna interakcija s HIV proteini imunosorbenta različnih proteinov, prisotnih v krvi posameznikov z določenimi, pogosteje avtoimunskimi patološkimi procesi, kot so multipla skleroza, SLE, tuberkuloza; s pogostim darovanjem, nalezljivimi in onkološkimi boleznimi, opeklinami, nosečnostjo, ponavljajočimi se transfuzijami krvi, presaditvijo organov, tkiv, pa tudi osebami na hemodializi; s prisotnostjo revmatoidnega faktorja v krvi, ki pogosto izzove lažno pozitivne reakcije na HIV; prisotnost v krvi preiskovanih ljudi protiteles proti proteinom HIV gag in predvsem proti proteinu p24 (očitno se tvorijo protitelesa proti eksogenim ali endogenim retrovirusom, ki še niso identificirani). Ker se anti-p24 brez napak sintetizira v zgodnjih fazah serokonverzije HIV, se izvaja nadaljnji imunološki nadzor posameznikov s protitelesi proti HIV gag proteinom in njihova odstranitev iz darovanja.
Občutljivost in specifičnost encimskega imunskega testa nenehno narašča. Kot rezultat, ELISA četrte generacije po svojih diagnostičnih zmožnostih ni slabša od imunskega blotinga in se lahko uporablja ne le pri presejanju, ampak tudi v potrditveni fazi diagnosticiranja okužbe s HIV [Smolskaya T. T., 1997].
Imunobloting je končna metoda serološke diagnostike, ki omogoča končni sklep o HIV-pozitivnosti ali negativnosti subjekta.
Obstaja jasna korelacija med rezultati študije serumov v imunoblotu in ELISA - dvakrat pozitiven pri ELISA z različnimi testnimi sistemi, serum v 97-98% primerov se nato v imunoblotu izkaže za HIV-pozitiven. Če so bili serumi pri testu ELISA pozitivni samo v enem od dveh uporabljenih testnih sistemov, so pri imunoblotu pozitivni le v 4 % primerov. V 5% primerov lahko pri izvajanju potrditvenih študij pri ljudeh s pozitivnimi podatki ELISA imunoblot da "nedoločene" rezultate, med njimi pa v približno 20% primerov protitelesa proti HIV-1 gag proteinom (p55, p25, p18). ). Prisotnost protiteles samo proti HIV-1 gag proteinom je razlog za dodatno preiskavo krvnega seruma za okužbo s HIV-2.
Vrednotenje rezultatov imunoblotinga se izvaja strogo v skladu z navodili, priloženimi testnemu sistemu. Če ni navodil za razlago rezultatov, je treba uporabiti merila SZO.
Po prejemu pozitivnih rezultatov testov na referenčni stopnji laboratorijske diagnoze okužbe s HIV in negativnega rezultata študije z metodo imunskega blotinga se opravi obvezna ponovna strokovna diagnoza 6 mesecev po prvem pregledu.
Če rezultati imunoblotinga 12 mesecev po študiji prvega vzorca ostanejo negativni ali nedoločeni, potem v odsotnosti dejavnikov tveganja, kliničnih simptomov ali drugih dejavnikov, povezanih z okužbo s HIV, se oseba odstrani iz dispanzerskega opazovanja.
Med serološkimi metodami se v primeru nedoločenih rezultatov kot strokovna diagnoza uporablja imunoblot. radioimunoprecipitacija(POČIVAJ V MIRU). Temelji na uporabi virusnih proteinov, označenih z radioaktivnim jodom, precipitate pa zaznavamo s pomočjo beta števcev. Slabosti metode vključujejo visoke stroške opreme, potrebo po opremi posebnih prostorov za te namene.
Osebe z diagnozo okužbe s HIV so pod stalnim dinamičnim spremljanjem z obveznim laboratorijskim pregledom vsakih 6 mesecev.
Verižna reakcija s polimerazo (PCR) razkrije vnaprej pomnožene nukleotidne sekvence, specifične za genom danega patogena. Izolirano razmnoževanje gena ali njegovega fragmenta, imenovano pomnoževanje, PCR omogoča izvedbo in vitro z uporabo encima termostabilne DNA polimeraze. Za 2-3 ure PCR vam omogoča, da dobite milijone kopij določenega dela virusa. Pri okužbi s HIV iz celične RNK, vključno z RNK virusa, če je bila reproducirana v celici ali integrirana v njen genom z uporabo reverzne transkripcije in hibridizacije z označenimi oligonukleotidnimi "sondami", dobimo zadostno količino provirusne DNK za analizo, ki jo detektiramo in karakteriziramo kvantitativno, pa tudi glede na pripadnost genomu HIV, ugotavljanje homologije DNA in za virus specifičnih aminokislinskih zaporedij z radioaktivno ali drugo oznako sonde. Občutljivost PCR je odkrivanje virusnih genov v eni od pet tisoč celic.
PCR, vključno s kvantitativnim, se lahko uporablja le za določanje virusne obremenitve plazme, da se reši vprašanje začetka zdravljenja bolnika z zdravili ali zamenjave protiretrovirusnih zdravil. PCR ni mogoče priporočiti za diagnosticiranje okužbe s HIV, saj tudi najsodobnejše metode njegove formulacije in reagentov omogočajo določitev virusne obremenitve, ki ni nižja od določene ravni - 50 kopij / ml. Zapletenost vzpostavitve PCR in njeni visoki stroški (približno 200 dolarjev) zanikajo njeno obsežno uporabo kot metodo vsakodnevne laboratorijske diagnostike okužbe s HIV. PCR tako ostaja nepogrešljiv le za oceno virusne obremenitve plazme pri bolnikih z že postavljeno diagnozo okužbe s HIV, da bi rešili vprašanje zdravljenja bolnika.
Shematično so faze laboratorijske diagnoze okužbe s HIV prikazane na sl. eno.
riž. 1. Faze laboratorijske diagnoze okužbe s HIV
Med okužbo s HIV nastopi obdobje »temnega laboratorijskega okna«, ko je količina protiteles proti HIV nezadostna za občutljivost testnih sistemov. To obdobje se giblje od enega tedna do treh mesecev od trenutka okužbe s HIV, odvisno od stopnje občutljivosti testnega sistema. Zaradi tega pojava nastanejo težave pri pregledu darovane krvi oseb, ki so v omenjenem obdobju okužbe s HIV. Zato je bil v večini držav sveta uveden sistem za uporabo krvi šele po tem, ko je bila shranjena 3-6 mesecev, da se opravi obvezen ponovni pregled za okužbo s HIV pri darovalcih teh odmerkov krvi. in njegove komponente.
Za fazo primarnih manifestacij je značilna aktivnost replikativnega procesa. Nastala viremija in antigenemija povzročita nastanek specifičnih protiteles razreda IgM: anti-p24, anti-gp41, anti-gp120. Antigen p24 je pri nekaterih okuženih mogoče dokazati v krvi z ELISA že 2 tedna po okužbi in ga lahko določamo do 8. tedna. Poleg tega je v kliničnem poteku okužbe s HIV opaziti drugo povečanje vsebnosti proteina p24 v krvi, ki pade na obdobje nastanka stopnje aidsa.
Pojav popolne serokonverzije, ko se v periferni krvi zabeleži visoka raven specifičnih protiteles razreda IgG proti strukturnim proteinom HIV gp41, p24, gpl20, močno olajša diagnozo okužbe s HIV. Večina komercialnih kompletov je zasnovanih za označevanje prav takih protiteles.
Težave pri odkrivanju protiteles pri bolnikih z okužbo s HIV se lahko pojavijo v obdobjih masivne viremije in antigenemije, ko se razpoložljiva specifična protitelesa v krvi porabijo za vezavo virusnih delcev in je replikacijski proces pred nastankom novih protivirusnih protiteles.
Pri osebah z začetno oslabljenim imunskim sistemom se viremija in antigenemija pojavita prej in ostaneta na visoki ravni do izida bolezni. Hkrati imajo takšni bolniki nizko vsebnost prostih protiteles proti HIV zaradi dveh razlogov - nezadostne proizvodnje protiteles s strani B-limfocitov in protitelesa vezave virionov in topnih proteinov HIV, zato za določanje okužbe testni sistemi s povečano potrebna je občutljivost ali modifikacija analiznih metod, ki zagotavljajo stopnjo sproščanja protiteles iz imunskih kompleksov.
Kljub obilici specifičnih označevalcev okužbe s HIV je najpogosteje ugotovljena prisotnost skupnih protiteles proti proteinom HIV. Izraz "total" pomeni prisotnost dveh razredov protiteles (IgG in IgM) in širok spekter protiteles proti različnim, predvsem strukturnim proteinom HIV.
Določanje celic CD4. Glavni klinični in laboratorijski indikator za diagnosticiranje stopnje okužbe s HIV, stopnje uničenja imunskega sistema pri bolnikih v vsakdanjem življenju, je bila določitev vsebnosti limfocitov CD4+: zmanjšanje ravni pod 200 celic / mm3 je Glavni kriterij za diagnosticiranje aidsa. Menijo, da vsi s HIV okuženi posamezniki s številom limfocitov CD4+ 200 celic/mm3 ali manj potrebujejo protivirusno terapijo in profilakso pnevmocistične pljučnice. In čeprav 1/3 s HIV okuženih s številom limfocitov CO4+ manj kot 200 celic/mm3 nima kliničnih manifestacij, so izkušnje pokazale, da se pri njih pojavijo simptomi v naslednjih 2 mesecih, zato jih vsi obravnavamo kot bolnike z aidsom. stopnja.
Trenutno nove diagnostične tehnologije omogočajo prepoznavanje etioloških in patogenetskih vzrokov številnih bolezni in radikalno vplivajo na rezultate zdravljenja. Morda so bili najbolj impresivni rezultati uvedbe teh tehnologij v klinično prakso doseženi na področju imunologije in diagnostike nalezljivih bolezni.
Testni sistemi, ki temeljijo na encimskih imunosorbentnih in imunohemiluminescentnih testih, omogočajo odkrivanje protiteles različnih razredov, kar bistveno poveča informacijsko vsebino metod klinične, analitične občutljivosti in specifičnosti za diagnosticiranje nalezljivih bolezni. Treba je opozoriti, da je najpomembnejši napredek v diagnostiki okužb povezan z uvedbo v laboratorijsko prakso metode verižne reakcije s polimerazo, ki velja za "zlati standard" pri diagnosticiranju in ocenjevanju učinkovitosti zdravljenja okužb. število nalezljivih bolezni.
Za študijo lahko uporabimo različne biološke materiale: serum, krvno plazmo, strganje, biopsijo, plevralno ali cerebrospinalno tekočino (CSF). Najprej so metode laboratorijske diagnoze okužb namenjene prepoznavanju bolezni, kot so virusni hepatitis B, C, D, okužba s citomegalovirusom, spolno prenosljive okužbe (gonoreja, klamidija, mikoplazma, ureaplazma), tuberkuloza, okužba s HIV itd.
Okužba s HIV je bolezen, ki jo povzroča virus humane imunske pomanjkljivosti (HIV), ki dolgo časa vztraja v limfocitih, makrofagih, celicah živčnega tkiva, kar ima za posledico počasi napredujočo okvaro imunskega in živčnega sistema telesa, ki se kaže z sekundarne okužbe, tumorji, subakutni encefalitis in druge patološke spremembe.
Povzročitelji okužbe - virusi humane imunske pomanjkljivosti 1. in 2. tipa (HIV-1, HIV-2) - spadajo v družino retrovirusov, poddružino počasnih virusov. Virioni so sferični delci s premerom 100-140 nm. Virusni delec ima zunanjo fosfolipidno lupino, ki vključuje glikoproteine (strukturne beljakovine) z določeno molekulsko maso, merjeno v kilodaltonih. Pri HIV-1 so to gpl60, gpl20, gp41. Notranjo lupino virusa, ki pokriva jedro, predstavljajo tudi proteini z znano molekulsko maso - p17, p24, p55 (HIV-2 vsebuje gpl40, gpl05, gp36, p16, p25, p55).
Genom HIV vsebuje RNA in encim reverzna transkriptaza (revertaza). Da bi se genom retrovirusa povezal z genomom gostiteljske celice, se DNA najprej sintetizira na matrici virusne RNA z uporabo reversetaze. DNK provirusa se nato integrira v genom gostiteljske celice. HIV ima izrazito antigensko variabilnost, ki bistveno presega variabilnost virusa influence.
V človeškem telesu so glavna tarča virusa HIV T-limfociti, ki na svoji površini nosijo največje število receptorjev CD4. Ko HIV s pomočjo reverzaze vstopi v celico, virus sintetizira DNK po vzorcu svoje RNK, ki se integrira v genetski aparat gostiteljske celice (limfociti CD4) in tam ostane vse življenje v stanju provirusa. . Poleg T-limfocitov pomočnikov so prizadeti makrofagi, B-limfociti, nevroglialne celice, črevesna sluznica in nekatere druge celice. Razlog za zmanjšanje števila T-limfocitov (celic CD4) ni le neposredni citopatski učinek virusa, temveč tudi njihovo zlitje z neokuženimi celicami. Skupaj s porazom T-limfocitov pri bolnikih z okužbo s HIV opazimo poliklonsko aktivacijo B-limfocitov s povečanjem sinteze imunoglobulinov vseh razredov, zlasti IgG in IgA, in posledično izčrpanost tega dela imunskega sistema. Disregulacija imunskih procesov se kaže tudi v povečanju ravni α-interferona, β2-mikroglobulina in znižanju ravni IL-2. Zaradi disfunkcije imunskega sistema, zlasti z zmanjšanjem števila T-limfocitov (CD4) na 400 celic na 1 μl krvi ali manj, nastanejo pogoji za nenadzorovano razmnoževanje HIV z znatnim povečanjem števila virionov. v različnih okoljih telesa. Zaradi poraza številnih delov imunskega sistema oseba, okužena z virusom HIV, postane brez obrambe pred patogeni različnih okužb.
V ozadju naraščajoče imunosupresije se razvijejo hude progresivne bolezni, ki se ne pojavijo pri osebi z normalno delujočim imunskim sistemom. To so bolezni, ki jih je Svetovna zdravstvena organizacija (WHO) opredelila kot marker aidsa ali bolezni, ki opredeljujejo aids.
Bolezni, ki opredeljujejo AIDS
Prva skupina - bolezni, ki so značilne samo za hudo imunsko pomanjkljivost (raven CD4<200). Клинический диагноз ставится при отсутствии анти-ВИЧ-антител или ВИЧ-антигенов.
Druga skupina - bolezni, ki se lahko razvijejo v ozadju hude imunske pomanjkljivosti in v nekaterih primerih brez nje.
Zato je v teh primerih potrebna laboratorijska potrditev diagnoze.
Prva skupina:
- kandidiaza požiralnika, sapnika, bronhijev;
- zunajpljučna kriptokokoza;
- kriptosporidioza z drisko, ki traja več kot 1 mesec;
- citomegalovirusne lezije različnih organov razen jeter, vranice ali bezgavk pri bolniku, starejšem od 1 meseca;
- okužba, ki jo povzroča virus herpes simplex, ki se kaže z razjedami na koži in sluznicah, ki trajajo več kot 1 mesec, pa tudi bronhitis, pljučnica ali ezofagitis kakršnega koli trajanja, ki prizadenejo bolnika, starejšega od 1 meseca;
- generalizirani Kaposijev sarkom pri bolnikih, mlajših od 60 let;
- možganski limfom (primarni) pri bolnikih, mlajših od 60 let;
- limfocitna intersticijska pljučnica in/ali pljučna limfoidna displazija pri otrocih, mlajših od 12 let;
- diseminirana okužba, ki jo povzročajo atipične mikobakterije (kompleks mikobakterij M. avium intracellulare) z zunajpljučno lokalizacijo ali lokalizacijo (poleg pljuč) v koži, vratnih bezgavkah, bezgavkah korenin pljuč;
- pnevmocistična pljučnica;
- progresivna multifokalna levkoencefalopatija;
- toksoplazmoza možganov pri bolnikih, starejših od 1 meseca.
Druga skupina:
- bakterijske okužbe, kombinirane ali ponavljajoče se pri otrocih, mlajših od 13 let (več kot dva primera v 2 letih opazovanja): sepsa, pljučnica, meningitis, poškodbe kosti ali sklepov, abscesi, ki jih povzroča Haemophilus influenzae, streptokoki;
- razširjena kokcidioidomikoza (ekstrapulmonalna lokalizacija);
- HIV encefalopatija (HIV demenca, aids demenca);
- histoplazmoza z drisko, ki traja več kot 1 mesec;
- izosporiaza z drisko, ki traja več kot 1 mesec;
- Kaposijev sarkom v kateri koli starosti;
- možganski limfom (primarni) pri osebah katere koli starosti;
- drugi B-celični limfomi (z izjemo Hodgkinove bolezni) ali limfomi neznanega imunofenotipa: drobnocelični limfomi (kot je Burkittov limfom itd.); imunoblastični sarkomi (imunoblastični, velikocelični, difuzni histiocitični, difuzni nediferencirani limfomi);
- diseminirana mikobakterioza (ne tuberkuloza) z lezijami poleg pljuč kože, materničnega vratu ali bazalnih bezgavk;
- zunajpljučna tuberkuloza (s poškodbo notranjih organov, poleg pljuč);
- salmonelna septikemija, ponavljajoča se;
- HIV-distrofija (izčrpanost, nenadna izguba teže).
Tabela 1 (glej referenco zgoraj) navaja bolezni, ki opredeljujejo aids, in njihove etiološke dejavnike.
Obstaja veliko klasifikacij aidsa.
Po novi klasifikaciji, ki jo je predlagal ameriški center za nadzor bolezni (tabela 2 - glejte zgornjo povezavo do vira), se diagnoza aidsa postavi pri ljudeh z ravnijo limfocitov CD4 pod 200/μL, tudi v odsotnost bolezni, ki opredeljujejo aids.
Kategorija B vključuje različne sindrome, med katerimi so najpomembnejši bacilarna angiomatoza, orofaringealna kandidiaza, ponavljajoča se vulvovaginalna kandidiaza, ki jo je težko zdraviti, cervikalna displazija, karcinom materničnega vratu, idiopatska trombocitopenična purpura, listerioza, periferna nevropatija.
Protitelesa proti HIV-1 in HIV-2 v krvi
V krvnem serumu običajno ni protiteles proti HIV-1 in HIV-2.
Določanje protiteles proti HIV je glavna metoda laboratorijske diagnoze okužbe s HIV. Metoda temelji na encimskem imunskem testu (ELISA) - občutljivost je več kot 99,5%, specifičnost je več kot 99,8%. Protitelesa proti HIV se pojavijo pri 90-95% okuženih v 1 mesecu po okužbi, pri 5-9% - po 6 mesecih, pri 0,5-1% - pozneje. V fazi aidsa se lahko število protiteles zmanjša, dokler popolnoma ne izginejo.
Rezultat študije je izražen kvalitativno: pozitiven ali negativen.
Negativen rezultat testa kaže na odsotnost protiteles proti HIV-1 in HIV-2 v krvnem serumu. Laboratorij izda negativen rezultat takoj, ko je pripravljen. Po prejemu pozitivnega rezultata - odkrivanje protiteles proti HIV - da bi se izognili lažno pozitivnim rezultatom v laboratoriju, se analiza ponovi še 2-krat.
Imunobloting za protitelesa proti virusnim proteinom HIV v krvnem serumu
V krvnem serumu običajno ni protiteles proti virusnim proteinom HIV.
Metoda ELISA za določanje protiteles proti HIV je presejalna metoda. Po prejemu pozitivnega rezultata se za potrditev njegove specifičnosti uporabi metoda Western-blot - protiobarjanje v gelu protiteles v pacientovem krvnem serumu z različnimi virusnimi proteini, ki jih ločimo po molekulski masi z elektroforezo in nanesemo na nitrocelulozo. Določimo protitelesa proti virusnim proteinom gp41, gpl20, gpl60, p24, pi8, p17 itd.
V skladu s priporočili Ruskega centra za preprečevanje in obvladovanje aidsa je treba odkrivanje protiteles proti enemu od glikoproteinov gp41, gpl20, gpl60 šteti za pozitiven rezultat. Če se odkrijejo protitelesa proti drugim beljakovinam virusa, se rezultat šteje za dvomljiv, takega bolnika je treba pregledati dvakrat - po 3 in 6 mesecih.
Odsotnost protiteles proti specifičnim proteinom HIV pomeni, da je encimski imunski test dal lažno pozitiven rezultat. Hkrati je treba pri praktičnem delu pri ocenjevanju rezultatov metode imunoblotinga upoštevati navodila, ki jih je podjetje priložilo uporabljenemu "kompletu imunoblotinga".
Metoda imunoblotinga se uporablja za laboratorijsko diagnozo okužbe s HIV.
antigen p24 v krvnem serumu
Antigena p24 v krvnem serumu običajno ni.
Antigen p24 je protein nukleotidne stene HIV. Stopnja primarnih manifestacij po okužbi z virusom HIV je posledica začetka replikativnega procesa. Antigen p24 se pojavi v krvi 2 tedna po okužbi in ga lahko odkrijemo z ELISA v obdobju od 2 do 8 tednov. Po 2 mesecih od trenutka okužbe antigen p24 izgine iz krvi. V prihodnosti se v kliničnem poteku okužbe s HIV opazi drugo zvišanje vsebnosti proteina p24 v krvi. Pade na obdobje nastanka aidsa. Obstoječi testni sistemi ELISA za odkrivanje antigena p24 se uporabljajo za zgodnje odkrivanje HIV pri krvodajalcih in otrocih, določanje prognoze poteka aidsa in spremljanje poteka terapije pri bolnikih z aidsom. ELISA ima visoko analitično občutljivost, ki omogoča odkrivanje p24 antigena HIV-1 v krvnem serumu pri koncentraciji 5-10 pg / ml in HIV-2 - manj kot 0,5 ng / ml, in specifičnost. Vendar je treba opozoriti, da je raven antigena p24 v krvi podvržena individualnim variacijam, kar pomeni, da je le 20-30% bolnikov mogoče odkriti s to študijo v zgodnjem obdobju po okužbi (Rose N.R. et al., 1997).
Protitelesa proti antigenu p24 razredov IgM in IgG se pojavijo v krvi od 2. tedna, dosežejo vrh v 2-4 tednih in ostanejo na tej ravni različno dolgo: protitelesa razreda IgM - več mesecev, izginejo v enem letu po tem okužbo, protitelesa IgG pa lahko vztrajajo več let.
Algoritem za diagnosticiranje okužbe s HIV je odvisen od faze bolezni in je značilna sprememba v dinamiki odkrivanja protiteles različnih razredov (slika 1, 2 - glej povezavo do vira zgoraj).
Rezultat študije je izražen kvalitativno - pozitiven ali negativen. Negativen rezultat testa kaže na odsotnost protiteles proti HIV-1 in HIV-2 ter antigenu p24 v krvnem serumu.
Laboratorij izda negativen rezultat takoj, ko je pripravljen. Po prejemu pozitivnega rezultata - odkrivanje protiteles proti HIV-1 in HIV-2 in / ali antigen p24 - da bi se izognili lažno pozitivnim rezultatom v laboratoriju, se analiza ponovi še 2-krat.
Ne glede na dobljene rezultate laboratorij pošlje vzorec bolnikove krvi in rezultate 3 testov v regionalni center za AIDS za potrditev pozitivnega rezultata ali verifikacijo nedoločenega rezultata. V takih primerih regionalni center za AIDS izda končni odgovor za to študijo.
Odkrivanje HIV z verižno reakcijo s polimerazo (kvalitativno)
Odkrivanje HIV s polimerazno verižno reakcijo - PCR (kvalitativno) se izvaja z namenom:
- razrešitev vprašljivih rezultatov imunoblota;
- za zgodnjo diagnozo okužbe s HIV;
- spremljanje učinkovitosti protivirusnega zdravljenja;
- določitev stopnje bolezni AIDS (prehod okužbe v bolezen).
V primeru primarne okužbe s HIV metoda PCR omogoča odkrivanje HIV RNA v krvi že 10-14 dni po okužbi.
Rezultat študije je izražen kvalitativno: pozitiven ali negativen. Negativen rezultat testa kaže na odsotnost HIV RNA v krvi.
Pozitiven rezultat - odkrivanje HIV RNA - kaže na okužbo bolnika.
Odkrivanje HIV z verižno reakcijo s polimerazo (kvantitativno)
HIV običajno ni v krvi.
Neposredno kvantitativno določanje HIV RNA s pomočjo PCR omogoča natančnejše od določanja vsebnosti celic CD4 napovedati stopnjo razvoja aidsa pri osebah, okuženih z virusom HIV, torej natančneje oceniti njihovo preživetje. Visoka vsebnost virusnih delcev je običajno povezana z izrazito motnjo imunskega statusa in nizko vsebnostjo celic CD4. Nizko število virusnih delcev je na splošno povezano z boljšim imunskim statusom in višjim številom celic CD4. Vsebnost virusne RNA v krvi omogoča napovedovanje prehoda bolezni v klinično fazo. Ko je vsebnost HIV RNA-1> 74 100 kopij / ml, skoraj vsi bolniki razvijejo klinično sliko aidsa (Senior D., Holden E., 1996).
Pri ljudeh s koncentracijo HIV-1 v krvi >10.000 kopij/ml obstaja 10,8-krat večja verjetnost, da bodo zboleli za aidsom kot pri ljudeh s koncentracijo HIV-1 v krvi.<10 000 копий/мл. При ВИЧ-инфекции прогноз непосредственно определяется уровнем виремии. Снижение уровня виремии при лечении улучшает прогноз заболевания.
Skupina ameriških strokovnjakov je razvila indikacije za zdravljenje bolnikov s HIV. Zdravljenje je indicirano za bolnike s številom CD4 v krvi<300/мкл или уровнем РНК ВИЧ в сыворотке >20.000 kopij/ml (PCR). Ocena rezultatov protiretrovirusnega zdravljenja pri ljudeh, okuženih z virusom HIV, se izvaja z zmanjšanjem ravni serumske HIV RNA.
Z učinkovitim zdravljenjem se mora raven viremije v prvih 8 tednih zmanjšati za 10-krat in biti pod mejo detekcije metode (PCR) (<500 копий/мл) через 4-6 месяцев после начала терапии.
Tako so bile do danes uvedene številne raziskovalne metode, ki se uporabljajo v klinični praksi za diagnostiko okužbe s HIV, tako kot za vse ostale virusne okužbe. Med njimi imajo vodilno vlogo serološke študije. Glavne metode za diagnosticiranje okužb s HIV so predstavljene v tabeli 3 (glej zgornjo povezavo do vira), kjer so glede na pomembnost posamezne metode za odkrivanje virusov razdeljene na štiri stopnje:
- A - test se običajno uporablja za potrditev diagnoze;
- B - test je uporaben v določenih okoliščinah za diagnozo določenih oblik okužbe;
- C - test se redko uporablja v diagnostične namene, vendar je zelo pomemben za epidemiološke raziskave;
- Laboratoriji običajno ne uporabljajo testa D za diagnostične namene.
Ker je za diagnozo virusnih okužb poleg izbire optimalne metode analize enako pomembno pravilno določiti in odvzeti biomaterial za raziskave, tabela 4 (glej zgornjo povezavo do vira) podaja priporočila za izbiro optimalnega biomateriala. za preučevanje okužbe s HIV.
Za spremljanje okuženih s HIV je treba uporabiti možnosti celovite študije imunskega statusa - kvantitativno in funkcionalno določitev vseh njegovih povezav: humoralne, celične imunosti in nespecifične odpornosti na splošno.
V sodobnih laboratorijskih pogojih večstopenjski princip ocenjevanja imunološkega statusa vključuje določanje subpopulacije limfocitov, krvnih imunoglobulinov. Pri ocenjevanju kazalnikov je treba upoštevati, da je za okužbo s HIV značilno zmanjšanje razmerja CD4 / CD8 T celic manj kot 1. Indeks CD4 / CD8 1,5-2,5 - kaže na normergično stanje, več kot 2,5 - kaže na hiperaktivnost , manj 1,0 - kaže na imunsko pomanjkljivost. Tudi razmerje CD4/CD8 je lahko manjše od 1 pri hudem vnetju.
To razmerje je temeljnega pomena pri oceni imunskega sistema pri bolnikih z AIDS-om, saj HIV selektivno okuži in uniči limfocite CD4, zaradi česar razmerje CD4 / CD8 pade na vrednosti bistveno nižje od 1.
Ocena imunološkega statusa temelji tudi na identifikaciji splošnih ali "grobih" okvar v sistemu celične in humoralne imunosti: hipergamaglobulinemija (povečana koncentracija IgA, IgM, IgG) ali hipogamaglobulinemija v terminalni fazi; povečanje koncentracije imunskih kompleksov v obtoku; zmanjšana proizvodnja citokinov; oslabitev odziva limfocitov na antigene in mitogene.
Kršitev razmerja med populacijami v celotnem bazenu B-limfocitov je značilna za pomanjkanje humoralne imunosti. Vendar te spremembe niso specifične za okužbo s HIV in se lahko pojavijo pri drugih boleznih. Pri celoviti oceni številnih drugih laboratorijskih parametrov je treba upoštevati, da so za okužbo s HIV značilni tudi: anemija, limfopenija in levkopenija, trombocitopenija, zvišanje ravni β2-mikroglobulina in C-reaktivnega proteina, povečanje aktivnosti transaminaz v krvnem serumu.
Klinična in laboratorijska diagnostika okužbe s HIV ima tri smeri:
- Ugotovitev dejstva okužbe s HIV, diagnoza okužbe s HIV.
- Določitev stopnje kliničnega poteka bolezni in odkrivanje sekundarnih bolezni.
- Prognoza napredovanja kliničnega poteka bolezni, laboratorijsko spremljanje učinkovitosti zdravljenja in stranskih učinkov protiretrovirusnih zdravil.
1. Ugotavljanje okužbe s HIV, diagnoza okužbe s HIV
Za določanje okužbe s HIV se uporabljajo naslednji specifični kazalci: protitelesa proti HIV, antigeni HIV, HIV RNA in provirusna DNA. Protitelesa proti HIV se določajo z encimskim imunskim testom (ELISA) ali imunoblotingom, ki je v bistvu vrsta ELISA. Antigene (proteine) HIV določamo z ELISA. S pomočjo molekularno genetskih metod verižne reakcije s polimerazo (PNR) in bDNA je mogoče določiti HIV RNA in provirusno DNA. Uporaba dodatne metode hibridizacije nukleinskih kislin s specifičnimi DNA sondami vam omogoča, da preverite specifičnost zaporedij DNA, pridobljenih med PCR. Občutljivost PCR - odkrivanje virusnih genov v eni od pet tisoč celic.
Med primarno okužbo opazimo naslednjo dinamiko označevalcev HIV v krvi okuženih. V prvem mesecu se zaradi aktivacije replikativnega procesa močno poveča virusna obremenitev (vsebnost HIV RNA v plazmi), nato pa zaradi širjenja virusa in množične okužbe ciljnih celic v krvi in limfi. vozlišč, postane mogoče določiti provirusno DNA. Najpomembnejša diagnostična vrednost je dejstvo, da je odkrita provirusna DNA integrirana v genom ciljne celice.
Virusna obremenitev odraža intenzivnost procesa replikacije v okuženih celicah. V obdobju primarne okužbe je stopnja virusne obremenitve pri okužbi z različnimi podtipi HIV drugačna, vendar je dinamika njenih sprememb približno enaka. Torej, pri okužbi s podtipom B, na primer, če je v prvem mesecu po okužbi vrednost virusne obremenitve 700 kopij / ml, potem se v 2. mesecu zmanjša na 600, v 3. - na 100, v 4. - do 50 kopij / ml. Takšno dinamiko opazimo v ozadju povečanja vsebnosti specifičnih protiteles proti HIV v krvi. Za vsebnost provirusne DNA v mononuklearnih celicah krvi bolnikov, okuženih s HIV, je značilna relativna konstantnost v prvih 6 mesecih z majhnimi nihanji pri nekaterih podtipih. Tako obremenitve RNA in DNA niso enake.
V fazi inkubacije nekaj časa ni tvorbe specifičnih protiteles proti virusu HIV v zadostni količini, ki bi jo lahko določili z obstoječimi laboratorijskimi metodami. Pred odkritjem protiteles zelo kratek čas opazimo pojav v krvi proteina Nef, ki zavira replikacijski proces, in strukturnega proteina p24. Antigen p24 je mogoče odkriti v krvi z encimskim imunskim testom že 1-2 tedna po okužbi in ga je mogoče določiti do 8. tedna, nato pa se njegova vsebnost močno zmanjša. Poleg tega se v kliničnem poteku okužbe s HIV opazi drugo zvišanje vsebnosti proteina p24 v krvi. Pade na obdobje nastanka aidsa. Izginotje prostih (nevezanih na protitelesa) jedrnih proteinov p24 v krvi in pojav specifičnih protiteles proti proteinom HIV označujeta začetek serokonverzije (slika 9.6).
Viremija in antigenemija povzročata nastanek specifičnih protiteles razreda IgM (anti-p24, anti-gp41, anti-gp120, anti-gp160). Prosta protitelesa razredov IgM in IgG proti proteinu p24 se lahko pojavijo od 2. tedna, njihova vsebnost se poveča v 2-4 tednih in doseže določeno raven, ki ostane več mesecev (IgM) in let (IgG) (slika 9.7). ).
Pojav popolne serokonverzije, ko je v periferni krvi zabeležena visoka raven specifičnih protiteles razreda IgG proti strukturnim proteinom HIV p24, gp41, gp120, gp160, močno olajša diagnozo okužbe s HIV. Protitelesa proti HIV se pojavijo pri 90-95% okuženih v 3 mesecih po okužbi, pri 5-9% - v obdobju od 3 do 6 mesecev od trenutka okužbe in pri 0,5-1% - pozneje.
Kljub dejstvu, da se protitelesa proti virusu HIV pojavijo zadnja, je glavni laboratorijski diagnostični indikator doslej odkrivanje specifičnih protiteles z ELISA in imunoblotingom.
Podatki so predstavljeni v tabeli 9.2 [pokaži] in 9.3 [pokaži] , jasno dokazujejo visoko občutljivost sodobnih testnih sistemov ELISA pri odkrivanju protiteles proti HIV, ki presega občutljivost imunoblotinga. V nekaterih primerih, ko prejmete primarni pozitivni rezultat ELISA, ga lahko potrdite z imunoblotingom šele po 2-3 tednih.
| Tabela 9.3. Primer spremljanja serokonverzije (po H. Fleury, 2000) | |||||
| Trenutek opredelitve | p24 antigen, pg/ml | Protitelesa proti proteinom HIV | |||
| ELISA, OD arr/OD cr ** | Imunobloting | ||||
| HIV DUO | Gen zaslon | Uniforma | |||
| Bolnik 1 | |||||
| Predvsem | 17 | 1,24 | manj kot 1 | manj kot 1 | * |
| Po 4 dneh | 67 | 1,36 | 1,85 | manj kot 1 | - |
| V 7 dneh | * | 2,33 | 6,84 | manj kot 1 | - |
| Po 2 dneh | * | 6,77 | 15,0 | 4,8 | gp160 |
| Bolnik 2 | |||||
| Predvsem | 400 | 13 | manj kot 1 | manj kot 1 | - |
| V 5 dneh | 450 | 18 | 2,11 | manj kot 1 | - |
| Po 10 dneh | * | 33 | 12,19 | 2,9 | gp160 |
| Opomba: * - ni določeno ** - razmerje med optično gostoto preučevanega vzorca seruma in kritično (pražno) vrednostjo optične gostote |
|||||
Pri pregledu bolnikov z okužbo s HIV (okuženih s HIV) z uporabo imunobloting testnih sistemov vodilnih svetovnih podjetij so v vseh primerih odkrita protitelesa proti gp160 in p24/25, protitelesa proti drugim proteinom pa v 38,8-93,3% primerov (tabela 1). ).9.4 [pokaži] ).
Težave pri odkrivanju protiteles pri bolnikih z okužbo s HIV se lahko pojavijo v obdobjih velike viremije in antigenemije, ko so obstoječa specifična protitelesa v krvi povezana z virusnimi delci in je replikacijski proces pred nastankom novih protivirusnih protiteles. To stanje se lahko pojavi in izgine med infekcijskim procesom.
Pri bolnikih z začetno oslabljenim imunskim sistemom se viremija in antigenemija pojavita prej in ostaneta na visoki ravni do izida bolezni. Pri takšnih bolnikih je nizka vsebnost prostih protiteles proti HIV zaradi dveh razlogov - nezadostna proizvodnja protiteles s strani B-limfocitov in vezava protiteles na virione in topne proteine HIV, zato za določanje okužbe uporabite testne sisteme s povečano občutljivostjo. ali so potrebne modifikacije analiznih metod, ki vključujejo stopnjo sproščanja protiteles iz imunskih kompleksov.
Najpogosteje se zmanjšanje vsebnosti protiteles proti HIV zaradi navedenih razlogov pojavi v terminalni fazi, ko protitelesa proti HIV v serumu reza ne morejo biti zajete z metodami encimskega imunskega testa niti z imunoblotingom (Western blot). Poleg pojava specifičnih protiteles proti HIV je za imunski odziv v prvih 4 mesecih značilno zmanjšanje vsebnosti okuženih CD4+ v krvi in povečanje CD8+ celic. Nadalje se vsebnost celic, ki nosijo receptorje CD4 in CD8, stabilizira in ostane nekaj časa nespremenjena. Povečanje vsebnosti CD8-limfocitov je zaščitna reakcija, ker. celično odvisno citotoksičnost izvajajo CD8+-limfociti, ki so usmerjeni v uničenje s HPV okuženih celic. Sprva se citotoksični limfociti (CTL) odzovejo na regulatorni protein virusa Nef, ki ima pomembno vlogo pri zmanjševanju virusne (RNA) obremenitve v plazmi s HIV okuženega v prvih mesecih. Nato se oblikuje odziv CTL na druge, vklj. strukturnih proteinov HIV, zaradi česar se 12 mesecev po okužbi močno poveča cptotoksični učinek.
Sheme za laboratorijsko diagnozo okužbe s HIV
Ob upoštevanju dane dinamike specifičnih markerjev okužbe s HIV je v praksi priporočljivo upoštevati naslednje sheme laboratorijske diagnostike pri odraslih (sl. 9.8-9.10).
Sheme odražajo tri glavne faze primarne laboratorijske diagnoze okužbe s HIV:
- Pregledovanje.
- Referenca.
- Strokovnjak.
Potreba po več stopnjah laboratorijske diagnostike je predvsem posledica ekonomskih razlogov. Tako je na primer strošek izvedbe ene strokovne študije z uporabo domačih testnih sistemov z imunoblotingom do 40 ameriških dolarjev, presejanje (z ELISA) je približno 0,2, to je razmerje 1:200.
Na prvi stopnji (slika 9.8) se subjekti testirajo na protitelesa proti HIV z enim testnim sistemom ELISA, ki je zasnovan za odkrivanje protiteles proti obema vrstama virusa - HIV-1 in HIV-2.
Proizvajalci v predlaganih testnih sistemih kot antigensko osnovo uporabljajo virusni lizat, rekombinantne proteine, sintetične peptide. Vsak od naštetih nosilcev antigenskih determinant HIV ima svoje prednosti in slabosti. Zato je treba pri izbiri testnih sistemov približno enakih stroškov dati prednost kompletom z najvišjo občutljivostjo (po možnosti 100 %). Med testnimi sistemi enake cene in občutljivosti je priporočljivo, da se osredotočite na tiste z največjo specifičnostjo.
Na osnovi virusnega lizata so bili ustvarjeni prvi testni sistemi za laboratorijsko diagnostiko okužbe s HIV. V osemdesetih letih prejšnjega stoletja je bila za tovrstne testne sisteme značilna občutljivost manj kot 100 % in nizka specifičnost, ki se je kazala z velikim številom (do 60 %) lažno pozitivnih rezultatov.
Med nastankom viriona v kulturi limfocitov se njegova ovojnica ustvari iz zunanje membrane in zato vsebuje antigene glavnega histokompatibilnega kompleksa razredov I in II. Ta okoliščina povzroči lažno pozitivne reakcije v primeru, da so v krvi bolnikov prisotna protitelesa proti histokompatibilnim aloantigenom.
Kasneje so za pridobitev virusa predlagali uporabo kulture makrofagov, v kateri se virusni delci tvorijo predvsem znotrajcelično z brstenjem ne iz zunanje membrane celice, temveč iz membran endoplazmatskega retikuluma. Ta tehnologija je zmanjšala število lažno pozitivnih rezultatov.
Encimski imunski testi so priznani kot eni najboljših glede na najpomembnejše lastnosti - občutljivost in specifičnost - v sklopu katerih je kombinacija prečiščenega virusnega lizata s sintetičnimi peptidi, ki so antigensko najbolj pomembne regije virusnih proteinov oz. se uporabljajo rekombinantne beljakovine.
Občutljivost testnega sistema je odvisna tudi od lastnosti drugih komponent kompletov. Tako testni sistemi, ki uporabljajo konjugate, ki prepoznajo protitelesa ne samo razreda IgG, ampak tudi IgM in IgA, omogočajo odkrivanje zgodnejše faze serokonverzije. Obetavna se zdi uporaba testnih sistemov, ki lahko hkrati določajo protivirusna protitelesa in antigen p24, zaradi česar je laboratorijska diagnoza okužbe s HIV še zgodnejša.
Začetni pozitivni rezultat je treba ponovno preveriti s ponovnim testiranjem vzorca v istem testnem sistemu, vendar po možnosti v drugi seriji in pri drugem laboratoriju. Če je pri drugem pregledu rezultat negativen, se pregled opravi še tretjič.
Po potrditvi pozitivnega rezultata je zaželeno ponovno vzeti kri in jo pregledati za protitelesa proti HIV kot primarno. Ponavljajoče odvzeme krvi pomaga preprečiti napako, ki nastane zaradi netočnega označevanja epruvet in izpolnjevanja napotnic.
Serum, pozitiven na presejalni stopnji, se pošlje v referenčne študije, izvedene z uporabo dveh ali treh zelo specifičnih testnih sistemov ELISA. V primeru dveh pozitivnih rezultatov se opravi strokovna preiskava z imunoblotingom.
Uporaba testnih sistemov ELISA v referenčni diagnostiki, s katerimi lahko razlikujemo specifična protitelesa proti HIV-1 in HIV-2, olajša nadaljnje delo in omogoča takojšen strokovni pregled pozitivnega vzorca z ustreznim imunoblotingom (HIV- 1 ali HIV-2).
Laboratorijsko izvedensko mnenje o okužbi s HIV se izda samo na podlagi pozitivnega rezultata Western blota. Pri izvajanju strokovne diagnostike je treba uporabiti nomenklaturo genov in genskih produktov HIV, ki jo je leta 1990 predlagala skupina strokovnjakov WHO (tabela 9.5). [pokaži] ).
Specifičnost pasov na imunoblotu je treba oceniti zelo skrbno in natančno z uporabo rezultatov študij kontrolnih serumov (pozitivnih in negativnih), ki se izvajajo vzporedno s študijo poskusnih vzorcev, in vzorca imunoblota z oznako proteinov HIV (ki jih proizvajalec priloži testnemu sistemu). Razlago dobljenih rezultatov je treba izvesti v skladu z navodili, ki so priložena testnemu sistemu. Kriterij za pozitivnost je praviloma obvezna prisotnost protiteles proti dvema proteinoma (prekurzorju, zunanjemu ali transmembranskemu), ki ju kodira gen env, in morebitna prisotnost protiteles proti produktom dveh drugih strukturnih genov HIV - gag in pol ( Tabela 9.6 [pokaži] ).
| Tabela 9.6. Merila za razlago rezultatov imunoblota za HIV-1 in HIV-2 (WHO, 1990) | |||
| Rezultat | HIV-1 | HIV-2 | |
| Pozitivno | +/- pol pasovi +/- gag črte | 2 progi env (prekurzor, zunanji gp ali transmembranski gp) +/- pol pasovi +/- gag črte |
|
| Negativno | Pomanjkanje pasov, specifičnih za HIV-1 | Ni posebnih pasov za HIV-2 | |
| Negotovo | Drugi profili niso videti kot pozitivni ali negativni | ||
V primeru dvomljivega rezultata je treba uporabiti seznam priporočil za končno razjasnitev rezultatov imunoblotinga (tabela 9.7). [pokaži] ).
| Tabela 9.7. Priporočila za dokončno razjasnitev nedoločenih rezultatov imunoblotinga (WHO, 1990) | |
| Prisotnost trakov, ki ustrezajo proteinom HIV | Razlaga rezultata, nadaljnji ukrepi |
| HIV-1 | |
| Samo str.17 | |
| Samo p24 in gp160 | Takšna nenavadna slika se lahko pojavi na začetku serokonverzije. Vzorec je treba takoj ponovno testirati. V primeru pridobitve enakega profila je potrebno 2 tedna po odvzemu 1. vzorca odvzeti drugi vzorec za testiranje v imunoblotingu. |
| Drugi profili | Ti profili (gag in/ali pol brez env) lahko kažejo na serokonverzijo ali nespecifične reakcije. |
| HIV-2 | |
| Samo str.16 | Lahko se opredeli kot negativen, ne zahteva dodatnih opredelitev |
| I lane env z ali brez gag/pol | Isti vzorec je treba ponovno testirati z drugo serijo reagentov. |
| Samo p24 ali gp140 | Ta nenavaden profil se lahko pojavi zgodaj v serokonverziji. Vzorec je treba takoj ponovno testirati. V primeru pridobitve enakega profila je treba 2 tedna po odvzemu 1. vzorca odvzeti drugi vzorec za testiranje v imunoblotingu. |
| Drugi profili | Ti profili (gag in/ali pol brez env) lahko kažejo na serokonverzijo ali nespecifične reakcije. |
V skladu s priporočili Ruskega znanstveno-metodološkega centra za preprečevanje in obvladovanje aidsa se za pozitiven rezultat šteje prisotnost protiteles proti vsaj enemu od proteinov gp41, gp120, gp160 v kombinaciji s protitelesi proti drugim specifičnim virusom HIV. 1 beljakovin ali brez njih. Ta priporočila temeljijo na izkušnjah s serumi otrok iz bolnišničnih žarišč, v katerih so pogosto odkrili protitelesa le proti enemu od proteinov virusne ovojnice.
Glavnina prvotno pregledanih bolnikov, seropozitivnih pri ELISA, spada v fazo persistentne generalizirane limfadenopatije (PGL) ali v asimptomatsko fazo. Zato na imunoblotu (nitrocelulozni trak, na katerem so imobilizirani proteini HIV) običajno določimo naslednjo kombinacijo protiteles proti HIV-1: protitelesa proti ovojnim proteinom gp160, gp120 in gp41, ki jih kodira gen env, v kombinaciji s protitelesi proti jedrni proteini p24 (proteinski nukleokapsid, kodiran z genom gag) in p31/34 (endonukleaza, kodirana z genom pol).
Pozitivne reakcije samo z gag in/ali pol proteini se lahko pojavijo v zgodnji fazi serokonverzije in kažejo tudi na okužbo, ki jo povzroča HIV-2, ali nespecifično reakcijo.
Če je rezultat vprašljiv, je mogoče uporabiti različne metodološke tehnike za razjasnitev dejstva okužbe s HIV.
Glede na tehnične zmožnosti (razpoložljivost diagnostičnih kompletov in reagentov, opremljenost s posebno opremo in usposabljanje osebja) strokovni laboratorij izvaja dodatne diagnostične študije (slika 9.10).
V nekaterih primerih je priporočljivo uporabiti molekularne genetske metode za določanje genetskih zaporedij HIV v serumu, krvnih limfocitih ali punktatih bezgavk. Preverjanje specifičnosti zaporedij DNA, pridobljenih s PCR, lahko izvedemo s hibridizacijo nukleinskih kislin s specifičnimi DNA sondami.
Metodi radioimunoprecipitacije (RIP) in indirektne imunofluorescence (IFl) se lahko uporabita tudi za končno verifikacijo serumov z vprašljivimi rezultati imunoblota.
Odkrivanje HIV RNA v plazmi s kvalitativno ali kvantitativno metodo ni pomembno za diagnozo okužbe s HIV. Tak rezultat je treba potrditi s standardnimi metodami, kot je imunobloting, 2-4 mesece po prejemu začetnega vprašljivega ali negativnega odgovora.
Izolacija virusa HIV v celični kulturi je končna resnica. Vendar je metoda zapletena, draga in se izvaja samo v posebej opremljenih raziskovalnih laboratorijih.
Vsebnost celic CD4+ v krvi je nespecifičen indikator, vendar se lahko v spornih primerih (ELISA "+", imunoblot "-", prisotnost kliničnih znakov okužbe s HIV / aidsa) uporablja kot smernica. za strokovno odločitev. Če lahko laboratorij izvaja samo imunobloting, je treba upoštevati priporočila iz tabele 1. 9.7 in na sl. 9.9.
Osebe, katerih serumi imajo vprašljive (nedoločene) izvide pri strokovnem pregledu, razen v primerih odkritja protiteles samo proti p17 (HIV-1) ali p16 (HIV-2), je treba ponovno testirati v 6 mesecih (po 3 mesecih). V primeru prave okužbe s HIV po 3-6 mesecih opazimo "pozitiven" trend v spektru protiteles - dodatno nastajanje protiteles proti drugim proteinom virusa. Za lažno reakcijo je značilno vztrajanje dvoumnega vzorca imunoblota dolgo časa ali izginotje sumljivih trakov. Če so po določenem časovnem obdobju rezultati ponovljenega imunoblotinga negativni ali ostanejo vprašljivi, potem se lahko v odsotnosti dejavnikov tveganja, kliničnih simptomov ali drugih dejavnikov, povezanih z okužbo s HIV, oseba šteje za seronegativno za protitelesa proti HIV- 1 in HIV-2.
Lažno pozitivni rezultati zaradi vsebnosti v krvi bolnikov protiteles proti aloantigenom histokompatibilnosti, ki so del ovojnice HIV, se na imunoblotu pojavijo v obliki trakov na ravni gp41 in gp31. Vzroki za druge nespecifične reakcije (na primer na p24, pogosto pri posameznikih z avtoimunskimi procesi) še niso pojasnjeni.
Izboljšanje tehnologije za proizvodnjo testnih sistemov ELISA je omogočilo doseganje visoke občutljivosti - do 99,99%, medtem ko je občutljivost metode imunoblotinga 97%. Zato lahko negativen rezultat imunoblota s pozitivnimi rezultati ELISA kaže na začetno obdobje serokonverzije, za katero so značilne nizke ravni specifičnih protiteles. Zato je treba študijo ponoviti po 1,5-2 mesecih, to je času, ki je potreben za popolno serokonverzijo, da se doseže koncentracija specifičnih protiteles v krvi, ki je zadostna za odkrivanje z imunoblotingom.
Pozitiven rezultat (rezultati) študije na referenčni ali edini presejalni stopnji laboratorijske diagnoze okužbe s HIV, to je pozitiven rezultat v katerem koli testnem sistemu encimskega imunskega testa, ki na koncu ni potrjen s strokovnimi metodami, se razlaga kot prisotnost navzkrižnega -reaktivna protitelesa v krvi preiskovanih protiteles. Navzkrižna reaktivnost se nanaša na vezavo protiteles na nespecifična mesta na proteinih ali peptidih HIV, ki se uporabljajo kot antigenska osnova v testnem sistemu, pri katerem je rezultat pozitiven.
V odsotnosti imunske pomanjkljivosti in kliničnih znakov okužbe s HIV se takšne osebe štejejo za seronegativne za protitelesa proti HIV in jih je treba odjaviti.
Končna diagnoza okužbe s HIV se postavi le na podlagi vseh kliničnih, epidemioloških in laboratorijskih podatkov. Samo lečeči zdravnik ima pravico pacienta obvestiti o diagnozi okužbe s HIV.
Glavna metoda potrditvene (strokovne) laboratorijske diagnoze okužbe s HIV je imunobloting. Vendar pa je zaradi njegove manjše občutljivosti v primerjavi z ELISA številni raziskovalci predlagali uporabo kombinacije več testnih sistemov za končno določitev prisotnosti specifičnih protiteles proti HIV. Na primer, G. van der Groen et al. predlagal alternativo metodi imunoblotinga za preverjanje pozitivnih rezultatov presejalne faze laboratorijske diagnoze okužbe s HIV. Vključuje vzporedno preučevanje materiala v treh testnih sistemih, ki temeljijo na različnih metodah za odkrivanje specifičnih protiteles proti HIV (več variant ELISA, reakcija aglutinacije) z uporabo antigenov različne narave. Avtorji so lahko izbrali takšne kombinacije testnih sistemov, katerih uporaba zagotavlja 100-odstotno občutljivost in specifičnost v primerjavi z rezultati, pridobljenimi pri imunoblotingu.
Nizka cena te metode strokovne diagnostike je nedvomna prednost, vendar pomanjkanje informacij o tem, kateri specifični proteini virusa so protitelesa v bolnikovi krvi, ne omogoča ocene specifičnosti reakcije v vsakem posameznem primeru. kot sledenje spremembam v spektru protiteles v zgodnji fazi serokonverzije.
Laboratorijska diagnoza okužbe s HIV pri otrocih, rojenih od mater, okuženih s HIV, ima svoje značilnosti. Od trenutka rojstva lahko dolgo časa (do 15 mesecev) v krvi takšnih otrok krožijo materina protitelesa proti HIV. Samo imunoglobulini razreda IgG prodrejo skozi placentno pregrado, zato odkrivanje HPV-specifičnih mupoglobulinov razredov IgM in IgA pri otroku lahko potrdi okužbo, vendar negativni rezultat ne more nakazovati odsotnosti HIV.
Otroci, mlajši od 1 meseca, še nimajo replikacije HPV, PCR pa je edina metoda preverjanja. Potrditvena metoda je tudi določitev antigena p24 pri otrocih, starejših od 1 meseca.
Odsotnost protiteles proti HIV pri novorojenčkih ne pomeni, da virus ni prestopil placentne pregrade. V vsakem primeru so otroci mater, okuženih s HIV, podvrženi laboratorijski diagnostični preiskavi in opazovanju 36 mesecev od rojstva.
Rezultati laboratorijskih testov za označevalce okužbe s HIV zahtevajo natančno razlago in jih je treba obravnavati le v povezavi s podatki iz epidemioloških in kliničnih raziskav. Po drugi strani pa je treba opozoriti, da kljub visoki občutljivosti sodobnih metod negativni rezultati testa ne morejo popolnoma izključiti prisotnosti okužbe s HIV. Zato je negativen rezultat testa, na primer z imunoblotingom, mogoče formulirati le kot odsotnost specifičnih protiteles proti HIV-1 in HIV-2.
Diagnoza okužbe s HIV pri seronegativnih bolnikih
Kakovost testnih sistemov, ki se uporabljajo v laboratorijski diagnostiki okužbe s HIV, se vsako leto izboljšuje, njihova občutljivost pa se povečuje. Vendar pa lahko velika variabilnost virusa HIV povzroči nastanek novih tipov, protiteles proti katerim obstoječi testni sistemi morda ne bodo prepoznali. Poleg tega so znani primeri atipičnega humoralnega odziva imunskega sistema gostiteljskega organizma na virus. Tako je L. Montagnier leta 1996 poročal o dveh bolnikih z aidsom, pri katerih v zadnjih nekaj letih v krvi niso odkrili specifičnih protiteles, diagnoza je bila postavljena na podlagi kliničnih podatkov in laboratorijsko potrjena le z izolacijo HPV- 1 v celični kulturi. V takih primerih je treba uporabiti priporočila Svetovne zdravstvene organizacije, v skladu s katerimi je klinična diagnoza okužbe s HIV pri odraslih in otrocih možna ob prisotnosti ene od 12 bolezni, ki opredeljujejo aids:
- kandidiaza požiralnika, sapnika, bronhijev, pljuč;
- zunajpljučna kriptokokoza;
- kriptosporidioza z drisko, ki traja več kot en mesec;
- citomegalovirusna poškodba katerega koli organa (z izjemo in poleg jeter, vranice in bezgavk pri bolniku, starejšem od 1 meseca):
- okužba, ki jo povzroča virus herpes simplex in traja več kot 1 mesec pri bolniku, starejšem od 1 meseca;
- možganski limfom pri bolniku, mlajšem od 60 let;
- limfocitna intersticijska pljučnica pri otroku, mlajšem od 13 let;
- diseminirana okužba, ki jo povzročajo bakterije iz skupine Mycobacterium avium intracellulare ali M. Kansassii;
- pnevmocistična pljučnica;
- progresivna multifokalna levkoencefalopatija;
- toksoplazmoza centralnega živčnega sistema pri bolnikih, starejših od 1 meseca.
Prisotnost ene od teh bolezni omogoča diagnosticiranje okužbe z virusom HIV v odsotnosti laboratorijskega krvnega testa za prisotnost protiteles proti virusu HIV ali celo ob seronegativnem rezultatu.
Vir: Medicinsko laboratorijska diagnostika, programi in algoritmi. Ed. prof. Karpishchenko A.I., Sankt Peterburg, Intermedica, 2001
Diagnoza okužbe s HIV vključuje dve stopnji: ugotovitev dejanskega dejstva okužbe s HIV in določitev stopnje bolezni. Določitev stopnje je neločljivo povezana z razjasnitvijo narave poteka bolezni in nato oblikovanjem prognoze pri tem bolniku ter izbiro taktike zdravljenja.
Kot veste, diagnoza katere koli nalezljive bolezni temelji na primerjavi epidemioloških, kliničnih in laboratorijskih podatkov, pretiravanje vrednosti ene od skupin teh podatkov pa lahko povzroči diagnostične napake.
Epidemiološka merila za okužbo s HIV .
Prvi korak pri diagnosticiranju okužbe s HIV je zbiranje epidemiološke anamneze in drugih epidemioloških podatkov o bolniku, ki ga pregledujemo. Pomanjkanje epidemioloških podatkov lahko bistveno oteži diagnostiko okužbe s HIV in onemogoči izvajanje protiepidemičnih ukrepov.
Epidemiološka merila so včasih lahko odločilna pri postavitvi diagnoze okužbe s HIV, lahko pa tudi drugotnega pomena. Merilo za visoko verjetnost okužbe je odkrivanje dejavnikov tveganja za okužbo pri pregledani osebi, kot je transfuzija krvi darovalca, prejete od osebe, okužene s HIV, rojstvo otroka, okuženega s HIV, pri pregledani ženski. Velika verjetnost okužbe obstaja v primeru rojstva subjekta od matere, okužene s HIV, spolnega stika z osebo, okuženo s HIV, skupne parenteralne uporabe drog z osebo, okuženo s HIV. Določeno tveganje za okužbo je ugotovljeno pri zanesljivih parenteralnih posegih, ki se izvajajo z instrumenti, za katere je verjetno, da so kontaminirani s HIV (tj. v bolnišničnih in podobnih žariščih okužbe s HIV s parenteralnim prenosom HIV).
O opaznem tveganju za okužbo lahko govorimo v primerih, ko subjekt poroča o spolnem odnosu ali parenteralni uporabi drog na območjih, kjer je HIV izrazito razširjen med populacijsko skupino, ki ji subjekt pripada.
Hkrati pa spolni odnosi in uživanje drog na območjih z nizko razširjenostjo okužbe s HIV ne izključujejo možnosti okužbe s HIV.
Odsotnost zanesljivih dejavnikov tveganja za okužbo s HIV lahko povzroči dvome o laboratorijskih podatkih. V takih primerih je priporočljivo ponoviti laboratorijske preiskave.
Klinična merila za okužbo s HIV.
Zgodnja diagnoza okužbe s HIV zagotavlja pravočasno zdravljenje bolnika in uvedbo preventivnih ukrepov v izbruhu, ki preprečujejo nenameren prenos virusa z okužene osebe na zdravo osebo. Končno zgodnja diagnoza omogoča pravočasen klinični pregled, psihološko pomoč in socialno rehabilitacijo. Prvi uspehi pri zdravljenju bolnikov omogočajo z zgodnjo diagnozo bistveno podaljšanje življenja bolnikov in celo upanje na ozdravitev.
Kompleksnost zgodnje diagnoze na podlagi klinične slike je v nespecifičnosti, polimorfizmu simptomov v II. , glavobol, zlasti v ozadju kratkotrajne vročine (3-10 dni) s temperaturo 38-38,50 C, ki ga spremlja tonzilitis, sindrom podaljšane diareje, izguba teže v kratkem času, je treba najprej izključiti okužba z virusom HIV. Diagnozo v tem obdobju pomaga prepoznavanje različnih kožnih izpuščajev (lise, papule, roseole, pustule) ali furunculoze med objektivnim pregledom. Prisotnost limfadenopatije, tudi v primeru povečanja ene skupine bezgavk, še bolj pa pri generalizirani, je verjetneje klinično sumiti na okužbo s HIV. Za bolezen je še posebej značilno povečanje posteriornih vratnih, submandibularnih, supra- in subklavialnih, aksilarnih in ulnarnih bezgavk. Praviloma se povečajo v velikosti do 2-5 cm v premeru, so neboleče, gosto elastične konsistence, občasno se združijo v konglomerat. Za okužbo s HIV je zelo značilno povečanje več kot enega vozla, več kot ene skupine (z izjemo dimeljske), ki traja več kot 3 mesece.
Pogosto v zgodnji fazi bolezni prisotnost psiho-nevroloških simptomov: anksioznost, depresija, nestabilna hoja, zmanjšana ostrina vida, konvulzivni napadi z znaki poškodbe psiho-čustvene sfere (motnja spomina, pozabljivost, neustrezno vedenje, otopelost). čustev). Do najbolj značilnih lastnosti zgodnje faze okužbe s HIV vključujejo:
1. Izguba teže manj kot 10 %;
2. Spremembe na koži in sluznicah (seboroični dermatitis, folikulitis, prurigo, psoriaza, glivične okužbe nohtov, ponavljajoče se razjede v ustih, nekrotizirajoči gingivitis);
3 . Herpes zoster pri osebah, mlajših od 50 let;
4. Ponavljajoče se okužbe zgornjih dihalnih poti;
AT vmesna stopnja Najbolj značilne so bolezni, za katere je značilna klinika razširjene superinfekcije, ki nastane kot posledica imunske pomanjkljivosti:
1 . Progresivna izguba teže več kot 10%;
2 . Driska neznanega izvora, ki traja več kot 1 mesec;
3 . ustna kandidiaza;
4 . levkoplakija;
5. Pljučna tuberkuloza;
6. periferna nevropatija;
7. Lokalizirane oblike Kaposijevega sarkoma;
8. Širjenje herpes zoster;
9. Huda, ponavljajoča se bakterijska okužba (pljučnica, sinusitis, piomiozitis).
Za pozna faza, ki omogočajo diagnosticiranje okužbe s HIV ali v vsakem primeru izvedbo diferencialne diagnoze, vključujejo:
1. Pnevmocistična pljučnica;
2 . toksoplazmoza;
3. kriptokokoza;
4. okužba s CMV;
5. Herpes simplex;
6. Progresivna multifokalna levkoencefalopatija;
7. Histoplazmoza;
8. Candida ezofagitis;
9. okužba MAC;
10. Salmonelna septikemija;
11. Zunajpljučna tuberkuloza;
12. Limfom, Kaposijev sarkom;
13. kaheksija;
14. HIV encefalopatija.
Leta 1988 je Svetovna zdravstvena organizacija predlagala izvedbo klinične diagnoze ocena simptomov na voljo pri bolniku s sumom na okužbo s HIV:
Persistentna generalizirana limfadenopatija 0
Spremembe na koži in sluznicah 1
Hujšanje 1
Huda utrujenost 1
Herpes simplex 2
Driska, ki traja več kot 1 mesec. štiri
Vročina, ki traja več kot 1 mesec. štiri
Izguba teže več kot 10 % 4
Pljučna tuberkuloza 5
Ponavljajoča se bakterijska okužba 5
Oralna levkoplakija 5
Stomatitis, soor v ustih 5
Lokaliziran Kaposijev sarkom 8
Kaheksija 12
Hkrati se oceni vsota točk od 0 do 3, saj je verjetnost okužbe z virusom HIV zelo majhna, 4-11 točk - bolezen je verjetna in 12 ali več - zelo verjetna.
Na splošno je klinična diagnoza okužbe s HIV najprej diagnoza spektra patologije, povezane z aidsom, pri bolniku s sekundarno imunsko pomanjkljivostjo. Ker HIV-indikatorske bolezni vključujejo 23 nozoloških oblik, je najprimernejši sindromski pristop k diagnozi. Skoraj vedno ima bolnik sindrom splošne zastrupitve (nemotivirana šibkost, letargija, utrujenost), ki se razvije v ozadju dolgotrajne nizke telesne temperature ali vročine neznanega izvora, pogosteje ponoči in zjutraj, ki jo spremlja obilno znojenje. Sindrom nemotivirane generalizirane periferne limfadenopatije je stalen, v 20% ga spremlja hepatosplenomegalija različne resnosti. Eden od vodilnih sindromov bolezni je sindrom bronho-pulmonalne patologije, čeprav se v naprednih primerih bolezni razvijejo globoke lezije pljučnega tkiva v obliki pnevmocistične pljučnice, ker se pnevmocistoza razvije v ozadju globoke imunske pomanjkljivosti. Toda sindrom nemotivirane driske, ki traja več kot 1 mesec, se nanaša na zgodnji pojav, zanj je značilna odpornost na zdravljenje z zdravili. Eden od sindromov okužbe s HIV je valovita artralgija neznane etiologije. Najbolj značilne manifestacije bolezni so sindrom lezij kože in sluznice, ki se kaže z nespecifičnim makulopapuloznim izpuščajem, steroidno odpornim ekcemom in stafilokoknim impetigom. Dermatološke manifestacije vključujejo tudi ponavljajoče se glivične (mikoze, kandidiaze, bakterijske (folikulitis, furunkuloza, hidroadenitis), virusne (herpes) lezije kože in sluznic. Končno so za okužbo s HIV značilne tudi neoplazme, predvsem v obliki Kaposijevega sarkoma in limfom in nekatere druge vrste tumorjev.
Prisotnost vsaj dveh kliničnih in dveh kliničnih laboratorijskih simptomov (levkolifonevtropenija, hipogamaglobulinemija) zgoraj navedenih simptomov pri bolniku omogoča diagnosticiranje okužbe s HIV z visoko stopnjo gotovosti. Toda hkrati, če dva od sindromov, ki sta zelo pogosta pri bolnikih, kot sta zvišana telesna temperatura in limfadenopatija, vztrajata mesec ali več, se pojavi vztrajna nemotivirana driska, izguba teže za več kot 10 % ali obilno nočno potenje. na diagnozo in natančen laboratorijski pregled.
AT stopnja 2a na bolezen lahko sumimo le s simptomom persistentne generalizirane limfadenopatije pri ogroženem bolniku ali ob prisotnosti epidemiološke anamneze.
AT stopnja 2b(zgodaj ali blago), somatsko počutje, normalna aktivnost je še ohranjena. Poškodbe kože in sluznic niso hude, ponavljajoče se okužbe dihalnih poti niso generalizirane, izguba teže ne presega 10 %.
V skladu s priporočili Svetovne zdravstvene organizacije je zanesljiva klinična diagnoza okužbe s HIV pri odraslih in otrocih možna v prisotnosti ene od 12 bolezni, ki kažejo na aids: 1) kandidiaza požiralnika, sapnika, bronhijev, pljuč; 2) ekstrapulmonalna kriptokokoza; 3) kriptosporidioza z drisko, ki traja več kot en mesec; 4) citomegalovirusna poškodba katerega koli organa (z izjemo in poleg jeter, vranice in bezgavk pri bolniku, starejšem od 1 meseca); 5) okužba z virusom herpes simpleksa, ki traja več kot 1 mesec pri bolniku, starejšem od 1 meseca; 6) Kaposijev sarkom pri bolniku, mlajšem od 60 let; 7) možganski limfom pri bolniku, mlajšem od 60 let; 8) limfocitna intersticijska pljučnica pri otroku, mlajšem od 13 let, 9) diseminirana okužba, ki jo povzročajo bakterije iz skupine Mycobacterium avium intracellulare ali M. Kansassii; 10) pnevmocistična pljučnica; 11) progresivna multifokalna levkoencefalopatija; 12) toksoplazmoza centralnega živčnega sistema pri bolnikih, starejših od 1 meseca. Prisotnost ene od teh bolezni omogoča diagnosticiranje okužbe s HIV v odsotnosti serološkega encimskega imunskega testa ali celo ob seronegativnem rezultatu.
Nič manj zapleteno ni razlikovanje faz bolezni, tj. uprizoritev glede na klinična merila. Po mnenju strokovnjakov CDC (ZDA) je najbolj objektivno merilo število T-celic pomočnic in ne klinične manifestacije, saj se mnoga od teh stanj pogosto pojavljajo pri ljudeh, ki niso okuženi z virusom HIV. Leta 1991 je Center določil, da se diagnoza aidsa lahko postavi, če: a) ima okužena oseba eno od 23 z aidsom povezanih stanj ali b) je okužena s HIV in ima manj kot 200 celic CD4+/mm3.
Laboratorijska merila za okužbo s HIV.
Testiranje na okužbo s HIV je odvisno predvsem od:
2 . Osebe s kliniko kandidoznega ezofagitisa, kandidiaze bronhijev in pljuč, diseminirane ali zunajpljučne kokcidiomikoze, pnevmocistične pljučnice, zunajpljučne kriptokokoze, kriptosporidioze z drisko več kot 1 mesec, citomegalovirusne lezije notranjih organov, razen jeter, vranice, bezgavk v. bolniki, starejši od 6 mesecev, citomegalovirusni retinitis z izgubo vida, herpetična okužba z multifokalnimi razjedami, ki trajajo več kot 1 mesec, bronhitis, pljučnica ali ezofagitis, ponavljajoči se herpes zoster, diseminirana ali zunajpljučna histoplazmoza, pljučna ali zunajpljučna tuberkuloza, izosporioza z drisko, ki traja več kot 1 mesec, razširjene ali zunajpljučne MAC- okužbe, progresivna multifokalna levkoencefalopatija, toksoplazmoza možganov, salmonelna septikemija, Kaposijev sarkom, limfom, limfoidna intersticijska pljučnica (pri otrocih)
Trenutno se za laboratorijsko diagnozo okužbe s HIV uporabljajo različne metode za odkrivanje HIV, antigenov HIV in genskega materiala HIV ter metode za odkrivanje protiteles proti HIV. Vse te metode imajo različno učinkovitost, zahtevajo različno opremo in različne stopnje usposobljenosti osebja. Rezultati teh študij zahtevajo kompetentno razlago.
... diagnoza vsake nalezljive bolezni temelji na primerjavi epidemioloških, kliničnih in laboratorijskih podatkov, pretiravanje vrednosti ene od skupin teh podatkov pa lahko povzroči diagnostične napake.
Diagnoza okužbe s HIV vključuje dve stopnji:
jaz stopnja - ugotavljanje dejanskega dejstva okužbe s HIV
;
II stopnja - določitev stopnje bolezni
.
UGOTAVLJANJE DEJSTVA OKUŽBE S HIV
Ugotavljanje samega dejstva okužbe s HIV (tj. Identifikacija ljudi, okuženih s HIV), pa vključuje tudi dve stopnji:
I faza- povezani imunosorbentni test(ČE): metoda ELISA je presejalna (selektivna) - selekcija domnevno okuženih oseb, to je njen namen je identificirati sumljive osebe in izločiti zdrave osebe; protitelesa proti HIV odkrivamo z drugimi protitelesi proti želenim protitelesom (protitelesa proti drugim protitelesom). Ta "pomočna" protitelesa so označena z encimom. Vsi presejalni testi morajo biti zelo občutljivi, da ne bi zgrešili bolnika. Zaradi tega njihova specifičnost ni zelo visoka, kar pomeni, da lahko ELISA daje pozitiven odgovor ("verjetno bolan") pri neokuženih ljudeh (na primer pri bolnikih z avtoimunskimi boleznimi: revmatizem, sistemski eritematozni lupus itd.). Pogostnost lažno pozitivnih rezultatov pri uporabi različnih testnih sistemov se giblje od 0,02 do 0,5%. Če je ELISA osebe dala pozitiven rezultat, potem je za potrditev dejstva okužbe s HIV potrebno opraviti nadaljnji pregled. Pri izvajanju ELISA v 3-5% primerov so možni lažno negativni rezultati - če je do okužbe prišlo relativno nedavno in je raven protiteles še vedno zelo nizka ali v terminalni fazi bolezni, za katero je značilna huda poškodba imunski sistem z globoko kršitvijo procesa tvorbe protiteles. Zato se ob prisotnosti podatkov, ki kažejo na stik z okuženimi z virusom HIV, ponavljajoče študije običajno izvedejo po 2 do 3 mesecih.
II stopnja - imunobloting(v modifikaciji Western Blot, Western blot): je bolj zapletena metoda in služi za potrditev dejstva okužbe. Ta metoda ne zaznava kompleksnih protiteles proti virusu HIV, temveč protitelesa proti njegovim posameznim strukturnim proteinom (p24, gp120, gp41 itd.). Rezultati imunoblotinga se štejejo za pozitivne, če so odkrita protitelesa proti vsaj trem proteinom, od katerih enega kodirajo geni env, drugega geni gag in tretjega geni pol. Če se odkrijejo protitelesa proti eni ali dvema beljakovinama, se rezultat šteje za dvomljiv in zahteva potrditev. V večini laboratorijev diagnozo okužbe s HIV postavijo, če sočasno odkrijejo protitelesa proti proteinom p24, p31, gp4l in gpl20/gp160. Bistvo metode: virus se uniči na komponente (antigene), ki so sestavljene iz ioniziranih aminokislinskih ostankov, zato imajo vse komponente zore, ki se med seboj razlikujejo; nato se z elektroforezo (električni tok) antigeni porazdelijo po površini traku - če so v testnem serumu protitelesa proti HIV, bodo delovala z vsemi skupinami antigenov in to je mogoče zaznati.
Treba si je zapomniti da se protitelesa proti HIV pojavijo pri 90-95% okuženih v 3 mesecih po okužbi, pri 5-9% okuženih se protitelesa proti HIV pojavijo po 6 mesecih in pri 0,5-1% okuženih se protitelesa proti HIV pojavijo pozneje. V fazi aidsa se lahko število protiteles zmanjša, do popolnega izginotja.
V imunologiji obstaja nekaj takega "serološko okno" - obdobje od okužbe do pojava takšnega števila protiteles, ki jih je mogoče zaznati. Pri HIV to obdobje običajno traja od 2 do 12 tednov, v redkih primerih dlje. Med »serološkim oknom« je oseba po preiskavah zdrava, v resnici pa je okužena z virusom HIV. Ugotovljeno je bilo, da je lahko HIV DNK v človeškem genomu vsaj tri leta brez znakov delovanja in se protitelesa proti HIV (markerji okužbe s HIV) ne pojavijo.
V tem obdobju (»serološko okno«) je mogoče identificirati osebo, okuženo s HIV, in celo 1-2 tedna po okužbi z verižna reakcija polimeraze(PCR). To je izjemno občutljiva metoda – teoretično je mogoče zaznati 1 DNK na 10 ml medija. Bistvo metode je naslednje: z verižno reakcijo s polimerazo pridobimo veliko kopij nukleinske kisline (virus je nukleinska kislina - DNK ali RNK - v beljakovinskem ovoju), ki jih nato detektiramo z označenimi encimi ali izotopi. , pa tudi po značilni strukturi. PCR je draga diagnostična metoda, zato se ne uporablja presejalno in rutinsko.
DOLOČITEV STADIJA BOLEZNI
V središču aidsa je, najprej uničenje T-limfocitov-pomočnikov, označenih z monoklonskimi protitelesi - grozdi diferenciacije - kot CD4. V zvezi s tem je diagnoza in spremljanje napredovanja bolezni nemogoče brez nadzora subpopulacije T-pomočnikov, ki se najprimerneje izvaja z laserskim sortirnikom celic.
Za blago okužbo s HIVštevilo T-limfocitov je zelo spremenljiv pokazatelj. Na splošno je zmanjšanje števila celic CD4 (absolutno in relativno) ugotovljeno pri osebah, ki so se okužile s HIV pred vsaj enim letom. Po drugi strani pa je v zgodnjih fazah okužbe število T-supresorjev (CD8) pogosto močno povečano tako v periferni krvi kot v povečanih bezgavkah.
S hudim aidsom velika večina bolnikov ima zmanjšano skupno število T-limfocitov (manj kot 1000 na 1 μl krvi, vključno z limfociti CD4 - manj kot 22 na 1 μl, medtem ko absolutna vrednost vsebnosti CD8 ostaja v mejah normale). V skladu s tem se razmerje CD4/CD8 močno zmanjša. Odziv T-limfocitov in vitro na standardne antigene in mitogene se zmanjša v strogem skladu z relativno zmanjšanim številom CD4.
Za napredoval AIDS značilna splošna limfopenija, nevtropenija, trombocitopenija (zmanjšanje števila limfocitov, nevtrofilcev in trombocitov), anemija. Te spremembe so lahko posledica centralne inhibicije hematopoeze zaradi poraza hematopoetskih organov z virusom, pa tudi avtoimunskega uničenja celičnih subpopulacij na periferiji. Poleg tega je za AIDS značilno zmerno povečanje količine gama globulinov s prevladujočim povečanjem vsebnosti IgG. Bolniki s hudimi simptomi aidsa imajo pogosto povišane vrednosti IgA. Na nekaterih stopnjah bolezni se raven označevalcev aidsa, kot so 1-mikroglobulin, kislinsko stabilni interferon, 1-timozin, znatno poveča. Enako se zgodi z izločanjem prostega neopterina, metabolita makrofagov. Relativnega pomena vsakega od naštetih testov, katerih število nenehno narašča, še ni mogoče oceniti. Zato jih je treba obravnavati v interakciji z označevalci okužbe s HIV, tako imunovirološkimi kot citološkimi. Za klinični krvni test je značilna levkopenija, limfopenija (zmanjšanje števila levkocitov in limfocitov).
1. stopnja - " inkubacijska stopnja»
- protitelesa proti HIV še niso odkrita; diagnoza okužbe s HIV v tej fazi se postavi na podlagi epidemioloških podatkov in mora biti laboratorijsko potrjena z odkrivanjem virusa humane imunske pomanjkljivosti, njegovih antigenov, nukleinskih kislin HIV v bolnikovem krvnem serumu;
2. stopnja - " faza začetnih manifestacij»
- v tem obdobju je že proizvodnja protiteles:;
Stopnja 2A - " asimptomatski»
- okužba s HIV se kaže samo s tvorbo protiteles;
2B stopnja - " akutna okužba s HIV brez sekundarne bolezni»
- v krvi bolnikov je mogoče odkriti širokoplazemske limfocite - "mononuklearne celice" in pogosto opaziti prehodno znižanje ravni CD4-limfocitov (akutna klinična okužba se pojavi pri 50-90% okuženih posameznikov v prvih 3 mesecev po okužbi; začetek obdobja akutne okužbe je praviloma pred serokonverzijo, to je pojavom protiteles proti HIV);
2B stopnja - " akutna okužba s HIV s sekundarnimi boleznimi»
- v ozadju zmanjšanja ravni CD4-limfocitov in posledične imunske pomanjkljivosti se pojavijo sekundarne bolezni različnih etiologij (tonzilitis, bakterijska in pnevmocistična pljučnica, kandidoza, herpetična okužba itd.);
3. stopnja - " latentno»
- kot odziv na napredovanje imunske pomanjkljivosti se imunski odziv spremeni v obliki čezmernega razmnoževanja celic CD4, čemur sledi postopno zniževanje ravni limfocitov CD4, v povprečju s hitrostjo 0,05-0,07x109/l na leto. ; v krvi najdemo protitelesa proti HIV;
Faza 4 - " stopnja sekundarnih bolezni»
- izčrpavanje limfocitov CD4, koncentracija protiteles proti virusu se znatno zmanjša (odvisno od resnosti sekundarnih bolezni se razlikujejo stopnje 4A, 4B, 4C);
Stopnja 5 - " končni fazi»
- značilno zmanjšanje števila celic CD4 pod 0,05x109/l; koncentracija protiteles proti virusu je znatno zmanjšana ali protiteles morda ne bodo odkriti.