ТЕМА ЗАНЯТИЯ : Бактериологическая лаборатория и правила работы в ней. Классификация микроорганизмов. Морфология бактерий. Методы определения вида микробов. Бактериоскопический метод. Техника микроскопирования с иммерсионной системой.
УЧЕБНАЯ ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ : Ознакомиться с устройством бактериологической лаборатории и правилами работы в ней. Ознакомиться с принципами классификации микроорганизмов. Изучить морфологические признаки бактерий и методы определения вида микробов. Освоить бактериоскопический метод исследования и технику микроскопирования с иммерсионной системой.
ЗАДАЧИ ЗАНЯТИЯ :
1. Ознакомиться с устройством бактериологической лаборатории и правилами работы в ней.
2. Познакомиться с принципами классификации микроорганизмов.
3. Изучить морфологические признаки бактерий и методы определения вида микробов.
4. Освоить технику микроскопирования с иммерсионной системой.
Устройство бактериологической лаборатории
Бактериологическая лаборатория предназначена для исследования материалов, содержащих возбудителей бактериальных инфекций, для определения санитарно-микробиологических показателей, контроля состояния и напряженности специфического иммунитета и других микробиологических исследований. Бактериологическая лаборатория должна размещаться в изолированных от других лабораторий помещениях с необходимым оборудованием и мебелью. Лаборатория должна иметь отдельный вход, гардероб и душевую. В состав бактериологической лаборатории должны входить следующие помещения:
Комната приема и регистрации материалов;
Боксированные помещения для микробиологических исследований;
Автоклавная;
Моечная;
Виварий.
Комнаты для микробиологических исследований оборудуют термостатами, холодильниками, центрифугами, весами, водяными банями, электромагнитными мешалками. На столах размещают необходимую аппаратуру. Работу с инфицированным материалом проводят в боксе с предбоксником . У входа в бокс должен быть коврик, пропитанный дезраствором. В боксе разбирают поступившие пробы, готовят и фиксируют мазки-отпечатки, проводят посевы микроорганизмов на питательные среды. Поэтому в боксе располагают столы, на которых размещают необходимые для работы инструменты: емкости с дезрастворами для использованной посуды, штативы для пробирок, пробирки и чашки Петри с питательными средами, стерильные пипетки, ступки и т. д. В предбокснике в биксах необходимо иметь стерильные халаты, шапочки, маски, а также в предбокснике должна быть сменная обувь. В предбокснике можно размещать термостаты, холодильники, центрифуги и другое оборудование. В боксах и предбоксниках ежедневно проводят влажную уборку, дезинфекционную обработку и облучение с помощью бактерицидных ламп в течение 30-40 минут перед началом работы и после работы.
В автоклавной необходимо иметь два автоклава: один автоклав для чистых материалов (для стерилизации посуды, питательных сред, инструментов); другой автоклав для инфицированных материалов (для обезвреживания инфицированных инструментов и материалов).
Моечная предназначена для мытья посуды. Посуду, пипетки и инструменты, загрязненные инфицированным материалом, моют только после стерилизации. В ней размещают сушильные шкафы.
Виварием называется помещение, используемое для содержания лабораторных животных. В виварии необходимо иметь карантинное отделение, комнаты для экспериментальных и здоровых животных, помещения для мытья и дезинфекции клеток, инвентаря и спецодежды, кухню для приготовления корма, кладовую, фуражную, трупосжигательную печь. Все помещения вивария должны быть изолированы друг от друга.
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРИЯ - научно-практическое учреждение, выполняющее бактериологические, иммунологические и другие микробиологические исследования. В соответствии с дифференцированием микробиологии вообще и бактериологии как одной из ее отраслей существуют бактериологические лаборатории, имеющие разнообразные задачи и функции. Клинико-диагностические бактериологические лаборатории при больницах проводят исследования, необходимые для постановки или уточнения диагноза инфекционного заболевания, контролирующие эффективность лечения.
Специализация бактериологических лабораторий при больницах определяется профилем больницы (острые инфекционные заболевания, детские инфекционные заболевания, венерические заболевания, туберкулез и пр.). Бактериологические лаборатории при санитарно-эпидемиологических станциях, как и клинические лаборатории, занимаются диагностической работой, обслуживая больницы, не имеющие собственных лабораторий, проводят профилактическое обследование населения и санитарно-бактериологическое исследование пищевых продуктов и воды.
Кроме медицинских, существует широкая сеть ветеринарных бактериологических лабораторий, выполняющих диагностические и профилактические исследования инфекционных заболеваний у животных (см. Ветеринарная лаборатория). Узкоспециализированными являются бактериологические лаборатории, выполняющие контрольные функции, как, например, бактериологические лаборатории при водопроводных станциях, контрольные лаборатории на предприятиях, выпускающих вакцины, сыворотки и другие бактерийные препараты. Специальные бактериологические лаборатории организованы при дезинфекционных учреждениях. Их задачей является бактериологический контроль качества проведенной дезинфекции. Наряду с бактериологическими лабораториями медицинского и ветеринарного профиля существуют специализированные бактериологические лаборатории, обслуживающие нужды пищевой промышленности (винодельческие, хлебопекарные, пивоваренные и прочие предприятия), сельского хозяйства и пр. В отличие от перечисленных бактериологических лабораторий, решающих практические задачи, в структуре соответствующих научно-исследовательских институтов предусмотрены бактериологические лаборатории разных профилей, предназначенные для решения различных исследовательских задач. Бактериологические лаборатории могут быть стационарными и передвижными. Последние используются для санитарно-противоэпидемического обслуживания воинских частей, а также в экспедиционных, полевых условиях (см. Лаборатория , в военно-полевых условиях). Кроме передвижных, в войсках имеются и стационарные лаборатории. Специфика исследований, проводимых в бактериологических лабораториях, обусловливает структуру лабораторий и режим работы в них.
Основным требованием, предъявляемым к бактериологическим лабораториям и вытекающим из специфики ее работы, является создание условий, обеспечивающих выполнение исследований в максимально стерильных условиях и гарантирующих персонал и окружающих от возможного заражения. Структура бактериологической лаборатории включает: собственно лабораторию и ряд дополнительных к ней подразделений. К ним относятся: средоварня, моечная, препараторская, стерилизационная и виварий (см.). Перечисленные подразделения как самостоятельные структурные единицы входят в состав крупных бактериологических лабораторий. В небольших бактериологических лабораториях виварий и специальная препараторская отсутствуют, а средоварня и стерилизационная могут быть объединены в одном помещении.
Устройство и оборудование
Рис. 5. Стеклянные шпатели. Рис.6. Шпатель из платиновой проволоки.
Помещение бактериологических лабораторий должно быть светлым и достаточно просторным. Стены должны быть выкрашены масляной краской, а пол - не иметь щелей. Окна лаборатории следует ориентировать на север или северо-запад. При ориентировке на юг окна завешивают белыми шторами. В бактериологической лаборатории должна быть умывальная раковина или умывальник, над которыми на полке помещается бутыль с раствором для дезинфекции рук. Рабочий стол бактериолога, по возможности, располагают на расстоянии 1 м от окна и покрывают линолеумом или стеклом. На столе помещают газовую горелку (при отсутствии газовой - спиртовую). Обязательным оборудованием рабочего места является банка для пипеток с дезинфицирующим раствором (3% раствор карболовой к-ты), закрывающийся фарфоровый или стеклянный сосуд для ваты, колодка - держатель для бактериальной петли, набор бактериальных стандартов, штативов для пробирок, эмалированные кюветы, пинцеты, ножницы и скальпель, чистые предметные стекла с лунками и без них, а также покровные стекла. Обычно используют предметные стекла размером 26 X X 76 мм и толщиной 1 - 1,2 мм, покровные стекла 18 х 18 или 20 х 20 мм. Бактериологическая лаборатория должна быть снабжена металлическими подносами для переноса чашек Петри, оцинкованными ведрами или баками для сброса инфицированной посуды или инвентаря. Микроскопы хранят в футляре или под стеклянным колпаком. Рабочий стол не должен быть загроможден лишними предметами. Обычно в бактериологической лаборатории оборудуют дополнительный небольшой стол для окраски фиксированных препаратов. На таком столе располагают: набор необходимых красителей и реактивов в колодке с пипетками и резиновыми баллончиками (рис. 1), эмалированный кювет или кристаллизатор с подставкой для препаратов, проволочный пинцет или пинцет Корне (рис. 2) для фиксации предметных стекол, листы фильтровальной бумаги для удаления жидкости с промытых препаратов, промыватель (рис. 3) или бутыль с водой. Бактериологическая лаборатория оснащается разнообразной посудой, необходимой для проведения исследований. Кроме обычной химической посуды (цилиндры, колбы, мензурки, мерные пипетки и пр.), необходима специальная, предназначенная для бактериологических и иммунологических анализов посуда: 1) стеклянные чашки Петри, используемые для выращивания бактерий на плотных средах и получения изолированных бактериальных колоний; 2) бактериальные матрацы (рис. 4) - плоские склянки (размером 22 x 17 x 5 см), которые используются для выращивания большого количества бактерий; 3) пробирки Ру с перетяжкой для выращивания бактерий на косяках картофеля; 4) вассермановские пробирки длиной 90 мм и внутренним диаметром 9-10 мм для постановки реакции связывания комплемента и реакции агглютинации; 5) преципитационные пробирки длиной 90 мм и диаметром 3-5 мм для постановки реакции преципитации; 6) бактериальные пробирки, служащие для выращивания бактерий на твердых и жидких питательных средах; 7) пастеровские пипетки, используемые для посевов жидких материалов, разведения жидкостей капельным способом, нанесения красителей и пр.; 8) пипетки Мора или пипетки с шарообразным расширением в средней части для засева инфицированного жидкого материала, а также автоматические пипетки или пипетки с резиновыми грушами, исключающие насасывание материала ртом. Для выращивания культур в жидких питательных средах, хранения и розлива питательных сред, реактивов и пр. применяется обычная лабораторная посуда. Посуда, используемая в бактериологической лаборатории, должна быть предварительно выщелочена, для чего ее обычно кипятят в 1-2% растворе соляной кислоты. Дезинфекцию бактериологической посуды, в которой культивируют микробы, следует осуществлять только при помощи высокой температуры без применения каких-либо дезинфицирующих средств, так как присутствие последних даже в виде следов может в дальнейшем затормозить развитие микробов. Посевы микроорганизмов в бактериологической лаборатории производят с помощью бактериологических петель, стеклянных или платиновых шпателей (рис. 5 и 6). Выращивание бактерий осуществляется в воздушном термостате (см.), а в крупных бактериологических лабораториях - в специальных термостатных комнатах.
При необходимости точного контроля температуры и относительно кратковременном выращивании бактерий или при постановке иммунологических реакций удобно использовать водяные ультратермостаты. Каждая бактериологическая лаборатория, где занимаются исследованием анаэробов, должна быть снабжена анаэростатом (см.), эксикаторами и вакуумными насосами для удаления воздуха. Последние используются также при проведении фильтрования. Для достижения наилучших асептических условий, необходимых при проведении посевов, выделении или пересеве культур, бактериологические лаборатории оснащают специальными застекленными боксами с предбоксниками. В боксе имеются газовая горелка, сосуд с дезинфицирующим раствором, а там, где возможно, бактерицидная увиолевая лампа. В случае отсутствия стационарного бокса при проведении некоторых работ, требующих высокой степени асептики, можно пользоваться переносным настольным боксом (см. Боксы, микробиологические).
Рис. 7. Автоматический счетчик колоний с телевизионным контрольным приспособлением: 1 - чашка Петри с выросшими колониями; 2 - электронное табло с цифрами, указывающими количество колоний в чашке Петри; 3 - телеэкран для наблюдения за увеличенным изображением колоний, выросших в чашке Петри.
Бактериальные культуры, лечебные и диагностические сыворотки, фаги и другие субстраты биологического характера (сыворотки, растворы пептонов и пр.) хранят в холодильнике. Бактериальные культуры полагается сохранять в запаянных пробирках или ампулах, для чего в бактериологических лабораториях необходимо иметь горелку для запаивания или обычную паяльную лампу. Обязательной принадлежностью любой бактериологической лаборатории является микроскоп (см.). Для большинства исследований используют микроскоп МБИ-3 и осветители. Научно-исследовательские бактериологические лаборатории оснащены также фазово-контрастными, люминесцентными и электронными микроскопами. Для количественного учета колоний бактерий, выросших на чашках Петри, используют счетчики разных систем. Одним из таких счетчиков является автоматический счетчик со сканирующим устройством и телевизионным контрольным приспособлением, позволяющим подсчитывать до 500 чашек в час (рис. 7). Важными элементами оборудования бактериологических лабораторий являются аппараты для встряхивания, используемые в тех случаях, когда необходимо в течение определенного времени обеспечить перемешивание и встряхивание материала (дефибринирование крови, гомогенизация материала и пр.). Для осаждения плотных частиц (микробные клетки, клетки тканей, взвесь исследуемого материала), находящихся в жидкости, используют центрифуги (см.). Для проведения большинства исследований наиболее часто применяют центрифуги, вращающиеся со скоростью 3000 - 3500 об/мин. При отсутствии электрических центрифуг пользуются центрифугами с ручным приводом.
Деятельность бактериологических лабораторий во многом зависит от соблюдения основного требования - работы в асептических условиях со стерильными объектами (инструменты, питательные среды, посуда). Поэтому в оснащении бактериологических лабораторий значительное место занимает аппаратура для стерилизации (см.). В каждой бактериологической лаборатории имеется автоклав (см.), аппарат Коха, печь Пастера (см. Пастера печь), аппарат для свертывания сыворотки. Для стерилизации кипячением применяют обычные стерилизаторы (см.), нагреваемые от электрической сети или другими средствами.
Для стерилизация жидких субстратов, изменяющихся при воздействии температуры, используют бактериальные фильтры (см.). Высушивание увлажняемых объектов (посуда, инструменты) после стерилизации паром или под давлением производят в сушильных шкафах (см.). Оснащение бактериологических лабораторий, необходимое для приготовления наиболее употребительных питательных сред, кроме указанной аппаратуры, включает приспособления для розлива сред, наборы реактивов и посуды для проведения некоторых химических анализов (определение аминного азота, триптофана, хлоридов и пр.), а также приборы и реактивы для определения pH среды; универсальный индикатор, индикаторы и компаратор Михаэлиса или потенциометр.
Работа с животными в бактериологических лабораториях проводится в специальном помещении - виварии. В собственно бактериологических лабораториях опыты с животными не допускаются. Для проведения основных работ с животными (взятие крови, постановка биологических проб, диагностических реакций и пр.) необходимо иметь: весы для взвешивания мышей, свинок и кроликов, станки или приспособления для их фиксации (рис. 8), набор шприцев, номера для метки животных (или красители), депиляторы.
Специфика бактериологической работы определяет особенно высокие требования к чистоте помещений бактериологических лабораторий. Особое значение имеет чистота воздуха, отсутствие в нем пыли. Уборку помещений бактериологических лабораторий лучше производить в конце рабочего дня или за несколько часов до начала работы, так как пыль, поднятая в воздух при уборке, повышает содержание в нем микробов и затрудняет возможность стерильной работы. Целесообразно после уборки помещений перед работой подвергнуть их облучению увиолевыми бактерицидными лампами в течение 0,5-1 часа. В целях профилактики внутрилабораторного заражения и возможности распространения инфекции при работе в бактериологических лабораториях необходимо выполнять следующие основные правила: 1) все лица, находящиеся в лаборатории, должны быть в халатах; 2) не допускаются излишние разговоры и хождения; 3) каждый работник должен пользоваться только закрепленным за ним рабочим местом; 4) в бактериологической лаборатории запрещается прием пищи и курение; 5) при работе с заразным материалом необходимо пользоваться инструментами (пинцетами, иглами, крючками) и ни в коем случае не прикасаться к нему руками; весь инвентарь, находившийся в контакте с заразным материалом, подлежит стерилизации или уничтожению; 6) при отсасывании жидкого материала рекомендуется пользоваться резиновыми грушами; пипетки должны быть закрыты ватными пробками; 7) переливание инфицированных жидкостей из сосуда в сосуд производят над лотком или кристаллизатором, наполненным дезинфицирующей жидкостью; 8) всю работу, связанную с посевами, пересевами, выделением культур и приготовлением препаратов из инфицированного материала, проводят у горелки, обжигая при этом края пробирок, петли, шпатели и пр.; 9) пробирки, колбы, флаконы и пр., куда в процессе работы помещается инфицированный материал, немедленно надписываются с указанием характера материала, названия и номера культуры и даты; 10) если заразный материал попал на окружающие предметы, необходимо немедленно провести тщательную дезинфекцию: залить это место дезинфицирующим раствором, а затем, если это возможно, прожечь тампоном с горящим спиртом; 11) предметы и материалы, инфицированные во время работы, регистрируют, собирают в баки или ведра, закрывают, запечатывают и в тот же день стерилизуют; 12) культуры, если это необходимо, хранят в агаровых столбиках под маслом в запаянных пробирках с этикетками; 13) регистрация и учет всех культур, а также зараженных в ходе работы животных ведется в журнале по специальной форме.
Регламентация условий работы с возбудителями инфекционных заболеваний произведена в соответствии со степенью опасности микроорганизмов для человека. По этому признаку выделено четыре группы патогенных биологических агентов (ПБА):
Группа I: возбудители особо опасных инфекций (чума, натуральная оспа и др.)
Группа II: возбудители высококонтагиозных бактериальных, грибковых и вирусных инфекций (сибирская язва, холера, бешенство и др.)
Группа III: возбудители бактериальных, грибковых, вирусных и протозойных инфекций, выделенных в самостоятельные нозологические формы (коклюш, столбняк, туберкулез и др.)
Группа IV: возбудители бактериальных, грибковых, вирусных септицемий, менингитов, пневмоний, энтеритов, токсикоинфекций, острых отравлений (синегнойная инфекция и др.).
Большая часть микробиологических лабораторий работает с ПБА III и IV групп, а изучением возбудителей особо опасных инфекций (I и II группы) занимаются только специализированные лаборатории.
Базовые лаборатории, работающие с ПБА III и IV групп, должны соответствовать ряду требований (отдельное здание или отдельный вход, наличие систем водо-, электроснабжения, отопление, вентиляция и др.) и иметь необходимый набор помещений в соответствии с производственной мощностью и номенклатурой выполняемых исследований. Каждая лаборатория должна иметь «чистую» и «грязную» зоны.
«Грязная» зона включает помещения для приема и регистрации материала, боксы и комнаты для проведения микробиологических исследований, термостатная, автоклавная для обеззараживания материала. Окна и двери всех помещений должны герметично закрываться. Помещения для работы с живыми микроорганизмами должны быть оборудованы бактерицидными лампами, или иметь боксы биологической безопасности. Приточно-вытяжная вентиляция «грязной» зоны должна быть оборудована фильтрами тонкой очистки выбрасываемого воздуха. Обязательна маркировка столов, автоклавов, емкостей с дезинфицирующими растворами, стеллажей для чистого и инфицированного материала. Лаборатория должна быть оснащена специальной мебелью, иметь гладкие поверхности пола и стен, устойчивые к действию моющих и дезинфицирующих средств.
«Чистая» зона включает помещения для предварительных работ (моечная, препараторская, комната для приготовления и розлива питательных сред и др.), комнату для работы с документацией, помещения с холодильниками для хранения питательных сред и диагностических препаратов, гардероб для верхней одежды, комнату отдыха. В «чистой» зоне возможна работа с неживыми ПБА (серологические, молекулярно-генетические, биохимические исследования).
Обеспечение безопасности работы с патогенными микроорганизмами включает два основных фактора: технический и человеческий. Технический фактор - это наличие необходимых для работы помещений «чистой» и «грязной» зоны, оборудования, защитных систем и т.д. Человеческий фактор - это правильность действий человека по обеспечению безопасности, уровень владения профессиональной техникой, знание возможных источников и механизмов заражения, соответствующая подготовка и тренировка.
Работа в учебной бактериологической лаборатории также сопряжена с двумя опасными факторами - микроорганизмами, являющимися возбудителями инфекционных заболеваний и открытым огнем, что требует соблюдение мер противоэпидемической и противопожарной безопасности. Студенты обязаны ознакомиться с правилами техники безопасности и строго их соблюдать:
Необходимо:
· работать в медицинских халатах с длинным рукавом, медицинских шапочках и бахилах;
· личные вещи хранить в специально отведённом месте, верхнюю одежду оставлять в гардеробе;
· каждый вид деятельности осуществляется в определенной зоне: работа с микроорганизмами - на специально оборудованном лабораторном столе, заполнение протоколов - на рабочем столе;
· при попадании инфицированного материала на стол, пол и другие предметы немедленно сообщить преподавателю и произвести дезинфекцию;
· инфицированные материалы должны быть помещены в прочные непромокаемые контейнеры или контейнеры с дезинфицирующим раствором, которые закрывают перед удалением из лаборатории.
· во время проведения работы двери лаборатории должны держаться закрытыми.
· по окончании работы руки тщательно вымыть, а при необходимости обработать дезинфицирующим раствором.
· принимать пищу в лаборатории
· набирать жидкость в пипетку ртом
· зажигать одну спиртовку от другой
· переносить горящую спиртовку
· оставлять спиртовку горящей после окончания использования по назначению
· оставлять на рабочем месте нефиксированные препараты, чашки Петри с посевами и другую посуду с инфекционным материалом
· касаться руками исследуемого материала в засеянных чашках Петри
Оборудование для клинической микробиологии
Современное оборудование для автоматизации всех этапов микробиологического процесса в лаборатории микробиологии позволяет быстро идентифицировать микроорганизмы и определить их чувствительность к антимикробным средствам для назначения ранней адекватной терапии.
Автоматизация лаборатории микробиологии обеспечивает:
- Сокращение времени получения результата до 24-72 часов
- Уменьшение количества ошибок
- Эффективное снижение трудозатрат
- Увеличение производительности
- Повышение эффективности лечения пациента
- Снижение средней продолжительности койко-дня
- Возможность анализа ситуации в режиме реального времени
- Стандартизация чтения результ атов
- Создание базы данных
Полностью автоматизированная бактериологическая лаборатория BioMerieux
Микробиологическое оборудование Биовитрум
Компания Биовитрум является одним из лидеров по производству и поставкам специального микробиологического оборудования в России. Мы производим и продаем оборудование для микробиологических исследований разработанного по самым инновационным технологиям.
Оснащение микробиологической лаборатории должно в полной мере соответствовать современным нормам качества, технологичности и безопасности и помогать исследователю максимально эффективно решать поставленные задачи. Наряду со специализированными приборами и устройствами в лаборатории микробиологии должно присутствовать и общелабораторное оборудование , позволяющее улучшить качество и производительность труда лаборанта.
Современное общелабораторное оборудование,необходимое для работы микробиологической лаборатории
Работа микробиолога осуществляется в условиях строгой стерильности, позволяющей избежать микробной контаминации и диагностических ошибок. Поддерживать стерильные условия и защитить персонал лаборатории и объекты в исследуемой культуре от микробного обсеменения помогают Этот вид является неотъемлемым элементом оснащения микробиологической лаборатории, обеспечивающим сверхчистые условия работы. Одним из обязательных приборов в микробиологической лаборатории является , служащая для разделения растворов и жидких смесей на различные по плотности фракции. К лабораторному оборудованию общего назначения относятся также для хранения реагентов и поддержания рабочих температур. Использование низкотемпературных холодильников позволяет замораживать и безопасно хранить биологические образцы при температуре до -150°.
Аналитическое и вспомогательное общелабораторное оборудование
Расширить функциональные возможности микробиологической лаборатории позволяет использование аналитического общелабораторного оборудования . Качественно и количественно охарактеризовать состав исследуемых образцов можно с помощью в, повышающих производительность и удобство работы при рутинных исследованиях.
Все микробиологические, биохимические и моле-кулярно-биологические исследования микроорганизмов про-водят в специальных лабораториях, структура и оборудование которых зависят от объектов исследования (бактерий, вирусов, грибов, простейших), а также от их целевой направленности (научные исследования, диагностика заболеваний). Изучение иммунного ответа и серодиагностика заболеваний человека и животных осуществляют в иммунологических и серологичес-ких (serum — сыворотка крови) лабораториях.
Бактериологические, вирусологические, микологические и серологические (иммунологические) лаборатории входят в со-став санитарно-эпидемиологических станций (СЭС), диагнос-тических центров и крупных больниц. В лабораториях СЭС выполняют бактериологические, вирусологические и серологи-ческие анализы материалов, полученных от больных и контак-тировавших с ними лиц, обследуют бактерионосителей и про-водят санитарно-микробиологические исследования воды, воз-духа, почвы, пищевых продуктов и т.д.
В бактериологических и серологических лабораториях боль-ниц и диагностических центров проводят исследования с целью диагностики кишечных, гнойных, респираторных и дру-гих инфекционных заболеваний, осуществляют микробиологи-ческий контроль за стерилизацией и дезинфекцией.
Диагностику особо опасных инфекций (чума, туляремия, сибирская язва и др.) проводят в специальных режимных ла-бораториях, организация и порядок деятельности которых строго регламентированы.
В вирусологических лабораториях диагностируют заболева-ния, вызванные вирусами (грипп, гепатит, полиомиелит и др.), некоторыми бактериями — хламидиями (орнитоз и др.) и риккетсиями (сыпной тиф, Ку-лихорадка и др.). При организации и оборудовании вирусологических лабораторий учитывают спе-цифику работы с вирусами, культурами клеток и куриными эмбрионами, требующую строжайшей асептики.
В микологических лабораториях проводят диагностику за-болеваний, вызываемых патогенными грибами, возбудителями микозов.
Лаборатории обычно размещаются в нескольких помещени-ях, площадь которых определяется объемом работ и целевым назначением.
В каждой лаборатории предусмотрены:
а) боксы для работы с отдельными группами возбудителей;
б) помещения для серологических исследований;
в) помещения для мойки и стерилизации посуды, приготов-
ления питательных сред;
г) виварий с боксами для здоровых и подопытных живот-
ных;
д) регистратура для приема и выдачи анализов.
Наряду с этими помещениями в вирусологических лабора-ториях имеются боксы для специальной обработки исследуе-мого материала и работы с культурами клеток.
Оборудование микробиологических лабораторий
Лаборатории снабжены рядом обязательных приборов и аппаратов.
1. Приборы для микроскопии: биологический иммерсион-ный микроскоп с дополнительными приспособлениями (ос-ветитель, фазово-контрастное устройство, темнопольный кон-денсор и др.), люминесцентный микроскоп.
2. Термостаты и холодильники.
3. Приборы для приготовления питательных сред, растворов и т.д.: аппарат для получения дистиллированной воды (дистил-лятор), технические и аналитические весы, рН-метры, аппара-тура для фильтрования, водяные бани, центрифуги.
4. Набор инструментов для манипуляций с микробами: бак-териологические петли, шпатели, иглы, пинцеты и др.
5. Лабораторная посуда: пробирки, колбы, чашки Петри, матрацы, флаконы, ампулы, пастеровские и градуированные пипетки и др., аппарат для изготовления ватно-марлевых про-бок.
Крупные диагностические комплексы имеют автоматичес-кие анализаторы и компьютеризированную систему оценки полученной информации.
В лаборатории выделено место для окраски микроскопичес-ких препаратов, где находятся растворы специальных красите-лей, спирт, кислоты, фильтровальная бумага и др. Каждое рабочее место снабжено газовой горелкой или спиртовкой и емкостью с дезинфицирующим раствором. Для повседневной работы лаборатория должна располагать необходимыми пита-тельными средами, химическими реактивами, диагностически-ми препаратами и другими материалами.
В крупных лабораториях имеются термостатные комнаты для массового выращивания микроорганизмов, постановки се-рологических реакций. Для выращивания, хранения культур, стерилизации лабораторной посуды и других целей используют следующую аппаратуру.
1. Термостат. Аппарат, в котором поддерживается постоян-ная температура. Оптимальная температура для размножения большинства патогенных микроорганизмов 37 "С. Термостаты бывают воздушными и водяными.
2. Микроанаэростат. Аппарат для выращивания микроорга-низмов в анаэробных условиях.
3. С0 2 -инкубатор. Аппарат для создания постоянной тем-пературы и атмосферы определенного газового состава. Пред-назначен для культивирования микроорганизмов, требователь-ных к газовому составу атмосферы.
4. Холодильники. Используют в микробиологических лабора-ториях для хранения культур микроорганизмов, питательных сред, крови, вакцин, сывороток и прочих биологически актив-ных препаратов при температуре около 4 °С. Для хранения препаратов при температуре ниже О °С применяют низкотем-пературные холодильники, в которых поддерживается темпе-ратура —20 °С или —75 "С.
5. Центрифуги. Применяют для осаждения микроорганиз-мов, эритроцитов и других клеток, для разделения неоднород-ных жидкостей (эмульсии, суспензии). В лабораториях исполь-зуют центрифуги с различными режимами работы.
6. Сушилъно-стерилизационный шкаф (печь Пастера). Пред-назначен для суховоздушной стерилизации стеклянной лабо-раторной посуды и других жаростойких материалов.
7. Стерилизатор паровой (автоклав). Предназначен для сте-рилизации перегретым водяным паром (под давлением). В ми-кробиологических лабораториях используют автоклавы разных моделей (вертикальные, горизонтальные, стационарные, пере-носные).
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ, ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ, МИКОЛОГИЧЕСКИЕ, ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ЛАБОРАТОРИИ И ИХ ОБОРУДОВАНИЕ. УСТРОЙСТВО СОВРЕМЕННЫХ МИКРОСКОПОВ. МЕТОДЫ МИКРОСКОПИИ. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ МОРФОЛОГИИ МИКРООРГАНИЗМОВ
Программа
1. Правила работы и организация микробиологических (бактериологических, вирусологических, микологи-ческих) лабораторий.
2. Основные приборы и оборудование микробиологичес-кой лаборатории.
3. Микроскопы и микроскопическая техника. Правила работы с иммерсионным микроскопом (объективами).
Демонстрация
1. Устройство и применение основных приборов и обо-рудования, используемого в микробиологических ла-бораториях: термостата, центрифуг, автоклава, су-шильного шкафа, инструментария и посуды.
2. Устройство биологического микроскопа. Различные ме-тоды микроскопии: темнопольная, фазово-контрастная, люминесцентная, электронная.
3. Препараты микробов (дрожжей и бактерий) при раз-личных методах микроскопии.
Задание студентам
1. Микроскопировать и зарисовать препараты дрожже-подобных грибов рода Candida , используя различные виды микроскопии.
Методические указания
Правила работы в микробиологических лабораториях .
Работу в микробиологической лаборатории медицинского учреждения проводят с возбудителями инфекционных заболеваний — пато-генными микроорганизмами.
Поэтому для предохранения от заражения персонал обязан строго соблюдать правила внутрен-него распорядка:
1. Все сотрудники должны работать в медицинских халатах, шапочках и сменной обуви. Вход в лабораторию без халата категорически воспрещен. В необходимых слу-чаях работающие надевают на лицо маску из марли. Ра-бота с особо опасными микробами регламентируется спе-циальной инструкцией и проводится в режимных лабора-ториях.
2. В лаборатории запрещается курить и принимать пищу.
3. Рабочее место должно содержаться в образцовом порядке. Личные вещи сотрудников следует хранить в специально отведенном месте.
4. При случайном попадании инфицированного мате-риала на стол, пол и другие поверхности это место необ-ходимо тщательно обработать дезинфицирующим раство-ром.
5. Хранение, наблюдение за культурами микробов и их уничтожение должны производиться согласно специаль-ной инструкции. Культуры патогенных микробов реги-стрируют в специальном журнале.
6. По окончании работы руки следует тщательно вы-мыть, а при необходимости обработать дезинфицирующим раствором.
Микроскопы и методы микроскопии
Рис. 1.1. Микроскопы.
а — общий вид микроскопа "Биолам"; б — микроскоп МБР-1: 1 — основание микроскопа; 2 — предметный столик; 3 — винты для перемещения предмет-ного столика; 4 — клеммы, прижимающие препарат; 5 — конденсор; 6 — кронштейн конденсора; 7 — винт, укрепляющий конденсор в гильзе; 8 — рукоятка перемещения конденсора; 9 — рукоятка ирисовой диафрагмы кон-денсора; 10 — зеркало; 11 — тубусодержатель; 12 — рукоятка макрометричес-кого винта; 13 — рукоятка микрометрического винта; 14 — револьвер объек-тивов; 15 — объективы; 16 — наклонный тубус; 17 — винт для крепления ту-буса; 18 — окуляр.
Для микробиологических исследований используют не-сколько типов микроскопов (биологический, люминесцентный, электронный) и специальные методы микроскопии (фа-зово-контрастный, темнопольный).
В микробиологической практике применяют микроскопы отечественных марок: МБР-1, МБИ-2, МБИ-3, МБИ-6, "Био-лам" Р-1 и др. (рис. 1.1). Они предназначены для изучения формы, структуры, размеров и других признаков различных микробов, величина которых не менее 0,2—0,3 мкм.
Иммерсионная микроскопия
Применяется для увеличения разрешающей способности метода световой микроскопии . Раз-решающая способность системы светооптической микроско-пии определяется длиной волны видимого света и числовой апертурой системы. Числовая апертура показывает величину угла максимального конуса света, попадающего в объектив, и зависит от оптических свойств (преломляющей способности) среды между объектом и линзой объектива. Погружение объ-ектива в среду (минеральное масло, вода), имеющую высокий коэффициент преломления, близкий к таковому стекла, пре-пятствует рассеянию света от объекта.
Рис. 1.2. Ход лучей в иммерсионной системе, п — показатель преломления.
Рис. 1.3. Ход лучей в темнопольных конденсорах, а — параболоид-конденсор; б — кардиоид-конденсор; 1 — объектив; 2 — иммерсионное масло; 3 — препарат; 4 — зеркальная поверхность; 5 — диа-фрагма.
Таким образом достигается увеличение числовой апертуры и соответственно разре-шающей способности. Для иммерсионной микроскопии при-меняют специальные иммерсионные объективы, снабженные меткой (МИ — масляная иммерсия, ВИ — водная иммерсия). Предельная разрешающая способность иммерсионного микро-скопа не превышает 0,2 мкм. Ход лучей в иммерсионной системе показан на рис. 1.2.
Общее увеличение микроскопа определяется произведением увеличения объектива на увеличение окуляра. Например, уве-личение микроскопа с иммерсионным объективом 90 и окуля-ром 10 составляет: 90 x 10 = 900.
Микроскопия в проходящем свете (светлопольная микроско-пия) используется для изучения окрашенных объектов в фик-сированных препаратах.
Темнопольная микроскопия . Применяется для прижизненно-го изучения микробов в нативных неокрашенных препаратах. Микроскопия в темном поле зрения основана на явлении дифракции света при боковом освещении частиц, взвешенных в жидкости (эффект Тиндаля ). Эффект достигается с помощью параболоид- или кардиоид-конденсора, которые заменяют обычный конденсор в биологическом микроскопе (рис. 1.3). При этом способе освещения в объектив попадают только лучи, отраженные от поверхности объекта. В результате на темном фоне (неосвещенном поле зрения) видны ярко светя-щиеся частицы. Препарат в этом случае имеет вид, показанный на рис. 1.4, б (на вклейке).
Фазово-контрастная микроскопия . Предназначена для изуче-ния нативных препаратов. Фазово-контрастное приспособле-ние дает возможность увидеть в микроскоп прозрачные объек-ты. Свет проходит через различные биологические структуры с разной скоростью, которая зависит от оптической плотности объекта. В результате возникает изменение фазы световой волны, не воспринимаемое глазом. Фазовое устройство, вклю-чающее особые конденсор и объектив, обеспечивает преобра-зование изменений фазы световой волны в видимые изменения амплитуды. Таким образом достигается усиление различия в оптической плотности объектов. Они приобретают высокую контрастность, которая может быть позитивной или негатив-ной. Позитивным фазовым контрастом называют темное изо-бражение объекта в светлом поле зрения, негативным — свет-лое изображение объекта на темном фоне (см. рис. 1.4; на вклейке).
Для фазово-контрастной микроскопии используют обыч-ный микроскоп и дополнительное фазово-контрастное устрой-ство КФ-1 или КФ-4 (рис. 1.5), а также специальные освети-тели.
Люминесцентная (или флюоресцентная) микроскопия. Осно-вана на явлении фотолюминесценции.
Люминесценция — свечение веществ, возникающее под воздействием внешнего излучения: светового, ультрафиолето-вого, ионизирующего и др. Фотолюминесценция — люмине-сценция объекта под влиянием света. Если освещать люминес-цирующий объект синим светом, то он испускает лучи крас-ного, оранжевого, желтого или зеленого цвета. В результате возникает цветное изображение объекта.
Рис. 1.5. Фазово-контрастное устройство, а — фазовые объективы; б — вспомогательный микроскоп; в — фазовый кон-денсор.
Длина волны излучаемого света (цвет люминесценции) зависит от физико-хими-ческой структуры люминесцирующего вещества.
Первичная люминесценция биологических объектов (собст-венная, или биолюминесценция) наблюдается без предвари-тельного окрашивания за счет наличия собственных люминес-цирующих веществ, вторичная (наведенная) — возникает в ре-зультате окрашивания препаратов специальными люминесци-рующими красителями — флюорохромами (акридиновый оран-жевый, ауромин, корифосфин и др.). Люминесцентная микро-скопия по сравнению с обычными методами обладает рядом преимуществ: возможностью исследовать живые микробы и обнаруживать их в исследуемом материале в небольших кон-центрациях вследствие высокой степени контрастности.
В лабораторной практике люминесцентную микроскопию широко применяют для выявления и изучения многих микро-бов.
Электронная микроскопия . Позволяет наблюдать объекты, размеры которых лежат за пределами разрешающей способнос-ти светового микроскопа (0,2 мкм). Электронный микроскоп применяют для изучения вирусов, тонкого строения различных микроорганизмов, макромолекулярных структур и других суб-микроскопических объектов. Световые лучи в таких микроско-пах заменяет поток электронов, имеющий при определенных ускорениях длину волны около 0,005 нм, т.е. почти в 100 000 раз меньше длины волны видимого света. Высокая разре-шающая способность электронного микроскопа, достигаю-щая 0,1-0,2 нм, позволяет получить общее полезное увеличе-ние до 1 000 000.
Наряду с приборами "просвечивающего" типа используют сканирующие электронные микроскопы, обеспечивающие рель-ефное изображение поверхности объекта. Разрешающая спо-собность этих приборов значительно ниже, чем у электронных микроскопов "просвечивающего" типа.
Правила работы с микроскопом
Работа с любым световым микроскопом включает установку правильного освещения по-ля зрения и препарата и его микроскопию различными объек-тивами. Освещение может быть естественным (дневным) или искусственным, для чего используют специальные источники света — осветители разных марок.
При микроскопии препаратов с иммерсионным объективом следует строго придерживаться определенного порядка:
1) на приготовленный на предметном стекле и окрашенный мазок нанести каплю иммерсионного масла и поместить его на предметный столик, укрепив зажимами;
2) повернуть револьвер до отметки иммерсионного объек-тива 90х или 10Ох;
3) осторожно опустить тубус микроскопа до погружения объектива в каплю масла;
4) установить ориентировочный фокус при помощи макрометрического винта;
5) провести окончательную фокусировку препарата микро- метрическим винтом, вращая его в пределах только одного оборота.
Нельзя допускать соприкосновения объектива с пре-
паратом, так как это может повлечь поломку покровного стек-ла или фронтальной линзы объектива (свободное расстояние иммерсионного объектива 0,1—1 мм).
По окончании работы микроскопа необходимо удалить мас-ло с иммерсионного объектива и перевести револьвер на малый объектив 8х.
Для темнопольной и фазово-контрастной микроскопии ис-пользуют нативные препараты ("раздавленная" капля и др., см. тему 2.1); микроскопируют с объективом 40х или специальным иммерсионным объективом с ирис-диафрагмой, позволяющей регулировать численную апертуру от 1,25 до 0,85. Толщина предметных стекол не должна превышать 1 — 1,5 мм, покров-ных — 0,15—0,2 мм.