Pri diagnostike infekčných chorôb sa používajú rôzne laboratórne spôsoby detekcie patogénov. Jedným z najprogresívnejších, špecifických a presných laboratórnych testov je analýza metódy PCR, ktorá umožňuje určovanie prítomnosti kauzálnych činidiel v krvi a iných typoch biologického materiálu, na detekciu mikroorganizmov v prvých štádiách vývoja chorôb, v prípadoch infekcie nosiča.
Analýza na PCR na špeciálnom zariadení
Ako vykonávať diagnostické testy pomocou PCR
Polymerázová reťazová reakcia je laboratórna molekulárna biologická metóda na detekciu baktérií DNA a húb, DNA a RNA vírusov. Základom PCR je špeciálna enzymatická reakcia, ktorá sa vyskytuje v prítomnosti špeciálnych enzýmov a látok molekulárnej povahy. Vzhľadom k tomu, že spôsob je schopný stanoviť prítomnosť ochorenia priamo na kauzálny činidlo, je považovaný za najinmatívnejšie a citlivé pri identifikácii latentných infekcií a nosičov v porovnaní so všetkými ďalšími diagnostickými metódami.
Analýza biologických vzoriek pomocou PCR testovania vám umožňuje rýchlo detekovať prítomnosť samotných baktérií a vírusov.
Zostávajúce laboratórne metódy diagnózy spravidla určujú nepriame príznaky infekcie, alebo vyžadujú dlhý testovací postup.
Hlavné stupne PCR techniky sú:
- užívanie biologického materiálu, jeho dodanie do diagnostického laboratória, \\ t
- výber genetického materiálu baktérií a vírusov z materiálu priniesol
- priamo PCR analýza a dekódovanie získaných údajov.
Na formuláciu PCR reakcie, vzoriek kvapalín, tkanív, tajomstiev, v ktorých prítomnosť patogénnych mikroorganizmov zahŕňajú. Ako testovacie vzorky sa používa najčastejšie, žilová krv, plazma alebo krvné sérum. V laboratóriu sú bakteriálne a vírusové častice oddelené od zvyšných zložiek a použitia špeciálnych činidiel z neho DNA alebo RNA molekuly.
Polymerická reťazová reakcia
V ďalšom štádiu sa tieto genetické molekuly množia znásobiť v špeciálnych zariadeniach. Na to použite špeciálne enzýmy a molekuly, ktoré vám umožňujú umelo šíriť striktne definovaný typ DNA patriacim do jedného konkrétneho patogénu. V dôsledku reakcie sa vytvorí obrovské množstvo krátkych DNA fragmentov, identické s tými, ktoré sú zahrnuté v vírusoch a baktériách.
V tretej etape sa nahromadené fragmenty nachádzajú so špeciálnymi farbivami a vybavením na detekciu. Ak v počiatočnej vzorke obsahovalo patogénne mikroorganizmy, je v dôsledku reakcie vytvorený špecifický produkt a analýza vykazuje pozitívny výsledok. Ak patogén nebol v materiáli, reakčný produkt nie je syntetizovaný a test poskytuje negatívny výsledok.
Testovanie metódy PCR je jedným z najrýchlejších spôsobov diagnostikovania infekcií. Celý cyklus kontroly materiálu zaberá niekoľko hodín až jeden deň.
Metóda PCR - Essence
Je použitie viacmedzného formulára v reakcii opakovanej reprodukcie molekúl DNA, ktorá umožňuje presne stanoviť prítomnosť mikroorganizmov v biologických vzorkách s maximálnou citlivosťou. Dokonca aj menšia koncentrácia infekčných látok v tkanivách a telesných tekutinách môže viesť k syntéze obrovského množstva reakčného produktu a pozitívnym záverom.
Aké infekcie sú určené pomocou PCR testu
S pomocou PCR technológie, prítomnosť rôznych baktérií, kvasinkových buniek, detekciu vírusových častíc. V modernej diagnostickej praxi je PCR analýza najbežnejšia na detekciu patogénov nasledovných ochorení:
- Infekcia HIV (AIDS),
- hepatitída (hepatitída B, hepatitída C a ďalšie viac vzácnych odrôd), \\ t
- infekcia cytomegalovírusu,
- takmer všetky infekčné ochorenia močových ciest, \\ t
- kandidóza,
- mykoplazmóza
- infekcie spôsobené vírusmi herpesov, \\ t
- infekcia papilomorovírusu,
- toxoplazmóza
- Črevných ochorení
- difteria,
- tuberkulóza,
- zriedkavé ohniskové infekcie
- mononukleóza a mnoho ďalších.
Polymerázová reťazová reakcia je najbežnejšou, spoľahlivejšou a rýchlejou spôsobou detekcie genitálnych infekcií, hepatitídy, HIV, papillom a iných ochorení.
Pre mnoho diagnostikovaných porovnávaní PCR nie je jediným spôsobom, ako diagnostikovať. Diagnóza je potvrdená lekárom len pri pozorovaní iných príznakov ochorenia.
Diagram identifikácie vírusov a baktérií
Ale pre niekoľko prípadov je polymeráza reakcia "zlatý štandard" laboratórnej diagnostiky.
Zoznam infekcií detegovateľných PCR sa každý rok rozširuje. Vývoj metódy už umožnil určovať súčasne niekoľko patogénov. Toto slúžilo šírenie komplexných programov prieskumov. Medzi nimi: Komplexná štúdia mikroflóry na bakteriálnej vaginóze, definícii infekcií horáka, identifikácia vysokej a nízkej karcinogénnej osoby papilóm. Okrem toho je PCR krvný test zahrnutý do povinného nemocničného komplexu diagnostiky.
Použitím polymerázy reakcie boli vedci schopní určiť molekuly, ktoré signalizujú vývoj rôznych foriem malígnych nádorov - najazdená. Kvôli ktorej metóda našla aplikáciu v skorom detekcii rakoviny. PCR testy sa aktívne používajú na detekciu dedičných genetických defektov, vrátane prenatálnej diagnózy av procese plánovania tehotenstva.
Vlastnosti biologického materiálu pre analýzu PCR
Plotom určitého typu materiálu na štúdiu je určený typom infekcie, ktorú chcú diagnostikovať v dôsledku testovania. Ako študované vzorky sú plot:
- venózna krv
- slina
- zariadenie, ako je krčný kanál, na vnútornej strane tváre,
- vzorky hlienu
- moč
- tekutina
- vzorky spermií a protonačné tajomstvo,
- spúta a broncho-pľúcna lavica,
- výber uretry.
Výsledky môžu rozlúčiť iba špecialisti.
V prípade jednotlivých infekcií a so špeciálnym svedectvom môžu lekári priradiť analýzu chlebovej tekutiny. Pri detekcii intrauterénnych ochorení sa používajú vzorky placenty a vretenovej vody.
Všeobecne platí, že na diagnostiku s PCR sa použije typ materiálu, v ktorom je samotné kauzačné činidlo priamo prítomné. Typ biologického materiálu je určený lekárom, keď je analýza na analýze.
Aby sa analýza bola presná a správna, je potrebná jednoduchá príprava pred plotom materiálu a dodržiavania špeciálnej čistoty predpokladu obrázkov a samotnej analýzy.
Ak chcete získať presný výsledok analýzy, mali by ste dodržiavať niekoľko pravidiel pre prípravu a plot materiálu na štúdium:
- zrušte priateľské kontakty niekoľko dní pred plotom materiálu z genitálnych orgánov a v prípade diagnostiky sexuálnych infekcií pre krvný test,
- venózna krv na PCR analýze na odovzdanie ráno, pred tým, než prejdeš nepiť nápoje a jedlo,
- nefajčite aspoň dve hodiny pred dodaním krvi,
- moč zozbierajte striktne do sterilnej nádoby bezprostredne po spánku.
DÔLEŽITÉ! Príjem antibiotík a iných liekov môže skresliť výsledky analýzy. Pred dodaním materiálu by sa malo konzultovať s lekárom.
Ak je PCR analýza plánuje byť plotom genitálneho materiálu, odporúča sa zrušiť použitie antibakteriálnych hygienických a silných liekov v koordinácii s navštevujúcim lekárom.
Ako dešifrovať výsledok analýzy PCR
Výsledky PCR analýzy sú zvyčajne reprezentované vo formáte vysokokvalitného kvality. Infekčné činidlo je buď detegované vo vzorke biologického materiálu, alebo sa v ňom nezistí.
Výklad záveru v tomto prípade je čo najjednoduchší: \\ t
- pozitívny výsledok naznačuje, že mikroorganizmus bol prítomný v analyzovanej vzorke,
- záporný test označuje, že infekčné činidlo nebolo zistené.
Pozor! Negatívny výsledok je niekedy dôsledkom nesprávneho plot materiálu alebo chýb v procese analýzy.
V prítomnosti zjavných symptómov ochorenia a podozrenia z falošne negatívneho výsledku môže byť vhodné zopakovať štúdiu.
PCR analýza vyžaduje veľkú presnosť
V špeciálnych prípadoch sa používajú kvantitatívne metódy stanovenia patogénu. Výsledky takýchto analýz sa vydávajú vo forme získanej koncentrácie DNA alebo RNA kauzačného činidla, pokiaľ ide o určité množstvo materiálu. Napríklad v kópiách molekúl DNA na mililiter krvnej plazmy.
Kvantitatívna a polo-kvantitatívna analýza PCR a dešifrovania jej výsledkov sa vykonávajú na monitorovanie priebehu ochorenia, určujúce vírusové zaťaženie, identifikáciu stupňa ochorenia, diagnostikovanie chorôb spôsobených podmienkovými patogénmi.
Pozitívne strany na diagnostiku pomocou PCR
Aktívne zavedenie spôsobu reakcie polymerázovej reťazovej reakcie na diagnózu takejto širokej škály infekčných ochorení bola umožnená niekoľkými jeho výhodami:
- vysoká špecificita metódy - Analýza umožňuje zistiť striktne definovaný typ DNA patogénov,
- schopnosť vytvoriť analýzu prietoku a automatizácie procesu, \\ t
- vysoká citlivosť metódy a schopnosť diagnostikovať ochorenie v počiatočných štádiách,
- diagnostika súčasne niekoľko infekcií;
- rýchlosť postupov a malé náklady na spotrebný materiál.
Nevýhody spôsobu zahŕňajú potrebu drahých zariadení, vysoké nároky na čistotu a technologickú metódu laboratória, možnosť získania falošných výsledkov v nedodržaní analytickej techniky.
Pre primerané a účinné zaobchádzanie s mnohými infekčnými chorobami je potrebné včasné stanoviť presnú diagnózu. Pri riešení tejto úlohy, dnešné high-tech diagnostické metódy založené na metódach molekulárnej biológie. V súčasnosti je polymerázová reťazová reakcia (PCR) už pomerne široko používaná v praxi ako najspoľahlivejší nástroj pre laboratórnu diagnostiku.
Čo je v súčasnosti vysvetlené PCR?
Po prvé, táto metóda sa používa na identifikáciu patogénov rôznych infekčných ochorení s vysokou presnosťou.Po druhé, na kontrolu účinnosti liečby.
V rôznych usmerneniach, prospektoch, výrobkoch, ako aj vysvetlenia špecializovaných lekárov často uľahčujeme používanie nezrozumiteľných termínov a slov. Je naozaj ťažké povedať o high-tech produktoch vedy v každodenných slovách.
Aká je podstata a mechanika PCR diagnostiky?
Každý žijúci organizmus má svoje vlastné jedinečné gény. Gény sa nachádzajú v molekule DNA, čo je vlastne "navštíviť kartu" každého konkrétneho organizmu. DNA (genetický materiál) je veľmi dlhá molekula, ktorá sa skladá z "tehál" nazývaných nukleotidy. Každý kauzálny činiteľ infekčných ochorení, sú prísne špecificky umiestnené, to znamená, že v určitej sekvencii a kombinácii. Keď je potrebné pochopiť, či má človek konkrétny patogén, biologický materiál (krv, moč, slina, škvrna) je uzavretý, ktorý obsahuje DNA alebo mikróby DNA fragmenty. Ale počet genetických materiálov patogénu je veľmi malý a nie je možné povedať, čo presne mikroorganizmus patrí. Vyriešiť tento problém a slúži PCR. Podstatou polymerázovej reťazovej reakcie je, že malé množstvo materiálu sa odoberá pre štúdiu obsahujúcu DNA a v procese PCR, zvýšenie počtu genetického materiálu patriaceho do špecifického patogénu a teda môže byť identifikovaný.PCR Diagnostika je genetická štúdia biomateriálu.
Myšlienka metódy PCR patrí do amerického vedca K.Mullins, ktorý navrhol v roku 1983. Rozšírené klinické použitie však prijaté len v polovici 90. rokov XXVEK. Budeme sa zaoberať terminológiou, čo je to - DNA atď. Každá bunka akejkoľvek živej bytosti (zviera, rastliny, muž, baktérie, vírus) má chromozómy. Chromozómy sú držiteľom genetických informácií, ktoré obsahujú celú sekvenciu génov každej konkrétnej živej bytosti.
Každý chromozóm sa skladá z dvoch DNA nití vír do špirály voči sebe navzájom. DNA je chemicky deoxyribonukleová kyselina, ktorá pozostáva zo štruktúrnych zložiek - nukleotidy. Nukleotidy sú 5 druhov - Timin (t), adenozín (A), guanín (g), cytozín (C) a uracil (Y). Nukleotidy sú umiestnené v prísnom individuálnom sekvencii, tvoria gény. Jeden gén môže pozostávať z 20-200 takých nukleotidov. Napríklad gén kódujúci produkciu inzulínu pozostáva z 60 párov nukleotidov.
Nukleotidy majú doplnkový majetok. To znamená, že pred adeníc (A) v jednom DNA reťazci, Timin (t) je potrebný v inom reťazci a oproti guanínu (g) \u200b\u200b- cytozínu (C). Schematicky vyzerá takto:
Pán C.
T - A.
A - T.
Táto vlastnosť komplementárnosti je kľúčom k PCR.
Okrem DNA má rovnaká štruktúra RNA - ribonukleová kyselina, ktorá sa líši od DNA v skutočnosti, že namiesto Thymínu sa v ňom používa Uracil. RNA je brankárom genetických informácií v niektorých vírusoch, ktoré sa nazýva retrovírus (napríklad HIV).
Molekuly DNA a RNA môžu "znásobiť" (táto vlastnosť sa používa pre PCR). To sa deje takto: Dve DNA nite alebo RNA, odchádzajú od seba po stranách, špeciálny enzým sedí na každom vlákne, ktoré syntetizuje nový reťazec. Syntéza je na princípe komplementárnosti, to znamená, že ak je nukleotid pod pôvodným DNA reťazcom, potom v novo syntetizovanej, bude t, ak m je potom m, atď. Tento špeciálny enzým - "Builder" na spustenie syntézy potrebuje "semeno" - sekvencie 5-15 nukleotidov. Toto "semeno" je definované pre každý gén (chlamydia gén, mykoplazma , vírusy) experimentálne.
Každý cyklus PCR pozostáva z troch stupňov. V prvej fáze sa vyskytuje tzv. DNA výtok - to znamená separácia vzájomne prepojených dvoch reťazcov DNA. V druhom uskutoční prílohu "osivo" na miesto závitu DNA. A nakoniec, predĺženie dát DNA vlákien, ktorý je vyrobený enzýmom "Builder". V súčasnosti tento komplexný proces prebieha v jednej trubici a pozostáva z opakujúcich sa reprodukčných cyklov stanovenej DNA, aby sa dosiahol veľký počet kópií, ktoré môžu byť odhalené bežnými metódami. To znamená, že z jednej DNA nite, dostaneme stovky alebo tisíce.
Fázy výskumu PCR
Plot biologického materiálu pre výskum
Vzorka je iným biologickým materiálom: krv a jeho zložky, zavlažovanie, sliny, oddelené sliznicami, chrbticou oddelenou povrchmi rany, obsahom dutiny tela. Všetky bioprodule sa zbierajú na jednorazové nástroje a volaný materiál uzatvára v plastových sterilných skúmavkach alebo umiestnených na kultivačné médiá, po ktorej nasleduje transport do laboratória.Potrebné reagencie pridávajú potrebné činidlá a vložte do programovateľný termostat - termálny cyklus (zosilňovač). Zosilňovač 30-50 krát PCR cyklus pozostávajúci z troch stupňov (denaturácia, žíhanie a predĺženie) sa opakuje. Čo to znamená? Viac.
ETVÁTY UNREPRETANTY PCR Reakcia, kopírovanie genetického materiálu
I. PCR Stage - Príprava genetického materiálu na kopírovanie.Vyskytuje sa pri teplote 95 ° C, zatiaľ čo sú DNA vlákna odpojené, a "semená" môžu na nich sedieť.
"Seeds" sa vykonáva priemyselnou metódou pre rôzne vedecké a výrobné združenia a laboratóriá sa pripravujú. Súčasne, "semeno" na identifikáciu, napríklad Chlamydia, funguje len pre Chlamydia, atď. Ak sa teda testuje biomateriál na prítomnosť chlamydiálnej infekcie, "semeno" sa umiestni do reakčnej zmesi na chlamýdie; Ak testovanie biomateriálu na vírusoch Epstein-Barra, potom "semeno" pre vírus Epstein Barra.
II. Fáza - Združenie genetického materiálu kauzačného činidla infekcie a "semená".
Ak existuje DNA určeného vírusu alebo baktérií, "semeno" sedí na tejto DNA. Tento proces spájania "semena" je druhý stupeň PCR. Tento stupeň prechádza pri teplote 75 ° C.
Iii Štádium - kopírovanie genetického materiálu infekcie patogénu.
Toto je proces predĺženia alebo reprodukcie genetického materiálu, ktorý sa vyskytuje pri 72 ° C. Enzým "Builder" je vhodný pre "semená" a syntetizuje nový DNA reťazec. S koncom syntézy nového DNA reťazca končí cyklus PCR. To znamená, že pre jeden PCR cyklus sa zdvojnásobí zvýšenie počtu genetického materiálu. Napríklad v počiatočnej vzorke bolo 100 molekúl DNA akéhokoľvek vírusu, po prvom PCR cykle vo vzorke už 200 DNA molekuly testovacieho vírusu už bude. Jeden cyklus trvá 2-3 minúty.
Na vytvorenie dostatočného počtu genetického materiálu na identifikáciu sa zvyčajne vyrába 30-50 PCR cyklov, čo trvá 2-3 hodiny.
Identifikácia množstva genetického materiálu
Skutočná PCR končí na tom a potom neexistuje menej významná etapa identifikácie. Na identifikáciu sa používa spôsob elektroforézy alebo označených "semien". Pri použití elektroforézy sú získané DNA nite oddelené vo veľkosti a prítomnosť fragmentov DNA rôznej dĺžky ukazuje pozitívny výsledok analýzy (to znamená o prítomnosti vírusu, baktérií atď.). Pri použití označených "semien" sa do konečného produktu reakcie pridá chromogen (farbivo), v dôsledku čoho je enzymatická reakcia sprevádzaná tvorbou farby. Vývoj sfarbenia explicitne označuje, že v počiatočnej vzorke je prítomný vírus alebo iné detekovateľné činidlo. Dnes, pomocou označených "semien", ako aj vhodný softvér, môžete okamžite a "čítať" výsledky PCR. Toto je takzvanáReal-time PCR.
Prečo má PCR diagnostika takáto hodnotu?
Jednou z významných výhod metódy PCR je vysoká citlivosť - od 95 do 100%. Tieto výhody by však mali byť založené na nepostrádateľnom dodržiavaní týchto podmienok: \\ t
- správny plot, preprava biologického materiálu;
- prítomnosť sterilných, jednorazových nástrojov, špeciálnych laboratórií a vyškolených pracovníkov;
- prísne dodržiavanie techník a sterility počas analýzy
Možnosti stanovené v analýze PCR umožňuje dosiahnuť neprekonateľnú analytickú špecificitu. To znamená identifikáciu tohto mikroorganizmu, ktorý hľadal, a nie podobný alebo v blízkosti.
Diagnostická citlivosť a špecificita metódy PCR často presahujú tie a pre metódu kultúry s názvom "Zlatý štandard" na identifikáciu infekčných chorôb. Vzhľadom na trvanie kultúry kultúry (od niekoľkých dní do niekoľkých týždňov), výhoda metódy PCR sa zrejmé.
PCR v diagnostike infekcií
Výhody metódy PCR (citlivosť a špecificita) určujú širokú škálu aplikácií v modernej medicíne.
Hlavné oblasti Diagnostika PCR:
- diagnóza akútnych a chronických infekčných ochorení rôznych miest
- monitorovanie účinnosti terapie
- objasnenie typu patogénu
Použitie diagnostiky PCR sa vykonáva v agregáte s inými metódami výskumu (ELISA, FIF, útes atď.). Ich kombinácia a primeranosť určuje účasť na lekári.
Infekcie infekcií nájdených PCR
Vírusy:
- retrovírusy HIV-1 a HIV-2
- herpetyiformné vírusy
- jednoduché typy Herpes Virus 1 a 2
Polymerázová reťazová reakcia (PCR, PCR - polymerázová reťazová reakcia) je spôsob získania rôznych kópií určitých fragmentov DNA (gény) v biologickej vzorke.
Podstatou PCR ako spôsobu molekulárnej biológie je viacnásobné selektívne kopírovanie určitého génu (DNA rez) so špeciálnymi enzýmami v podmienkach in vitro.. Dôležitou znakom PCR je príprava kópií špecifickej časti DNA (gén) zodpovedajúce zadaným podmienkam. Synonymum pre proces kopírovania DNA je "amplifikácia". Replikácia DNA in vivo.môže byť tiež považovaný za zosilnenie. Na rozdiel od replikácie sa však v procese polymerázovej reťazovej reakcie amplifikujú krátke časti DNA (maximálne 40 000 párov nukleotidov).
Základné princípy
PCR je teda viacnásobné kopírovanie určitých fragmentov DNA in vitro v procese opakujúcich sa teplotných cyklov. Ako postupuje reakčný proces v rámci toho istého teplotného cyklu?
Tvorba nukleotidového reťazca sa uskutočňuje polymerázou enzýmu DNA. Na začatie práce však enzým vyžaduje starterovú stránku. Ako miesta, "priméry" (semená) sú syntetické oligonukleotidy s dĺžkou 15-20 nukleotidov. Priméry by mali byť dva (priame a reverzné), sú komplementárne na miesta DNA matrici a je to DNA fragment obmedzený primérmi, DNA polymeráza sa bude kopírovať na viacnásobný. Prevádzka polymerázy sa skladá v sekvenčnom pridávaní nukleotidov, komplementárnych sekvencií DNA matrice. V jednom teplotnom cykle sú teda opäť syntetizované dve nové DNA fragmenty (pretože molekula DNA - dvojvrstvová, potom matry spočiatku dva). Miliardy kópií sekcií DNA definovaného primérmi sa teda akumulujú na 25-35 cyklov v trubici. Štruktúra samostatného cyklu môže byť reprezentovaná takto:
- denaturácia DNA (roztavenie, rozdiely medzi reťazcami DNA) - 95 ° C - 1 alebo 2 minúty;
- Žíbové priméry (semená sú spojené s DNA matricou, teplota tohto stupňa je určená nukleotidovým zložením priméru) - 60 ° C (napríklad) - 1 minútu;
- predĺženie DNA (polymeráza syntetizuje DNA reťazec) - 72 ° C - 1 minútu (čas závisí od dĺžky syntetizovaného fragmentu).
Rámec prístrojov na použitie spôsobu použitia metódy polymerázovej reťazovej reakcie v laboratóriu by mala pozostávať z: \\ t
- (alebo ako sa nazýva aj termálny cyklista);
- systémy pre C (pre vizualizáciu výsledkov PCR);
- systémy (na analýzu výsledkov PCR);
- (pre prípravu vzorky);
- (Mechanické alebo elektronické).
Okrem hlavných a pomocných zariadení pre plné fungovanie laboratória PCR sú potrebné niektoré spotrebné materiály: sterilné tipy, trubice, statívy pre rúrky a dávkovače.
Reagenčná báza v bežnom laboratóriu PCR na vykonávanie plnohodnotného polymerázovej reťazovej reakcie zahŕňa enzým DNA polymerázy s pufrom, primérom (malé syntetické DNA fragmenty, komplementárny štart a koniec analyzovanej časti DNA matrice), zmes Nukleotidy (A, T, G, C). Purifikovaná voda je tiež nevyhnutná.
Výhody metódy PCR
Vysoká citlivosť štúdie
Citlivosť spôsobu je taká, že amplifikácia PCR a identifikuje cieľovú sekvenciu, aj keď sa vyskytne raz vo vzorke 105 buniek.
Špecifickosť analýzy
PCR vám umožňuje identifikovať DNA konkrétneho infekčného činidla v prítomnosti DNA iných mikroorganizmov a DNA hostiteľského organizmu, ako aj uskutočnenie genotypizácie. Výber zložiek reakcie (priméry) môžete súčasne identifikovať DNA blízkych mikroorganizmov.
Univerzálnosť metódy PCR
Faktom je, že pre PCR diagnózu infekčných chorôb, alebo dedičných ochorení osoby, môžete použiť rovnaké vybavenie, postupujte podľa univerzálnych postupov na prípravu vzoriek (vzoriek) a analyzovanie analýzy, ako aj rovnakého typu reagencie.
Čas
Dôležitou výhodou PCR je nedostatok etáp kultúry mikrobiologických prác. Príprava vzoriek, reakcie a analýza výsledkov sa uľahčuje čo najviac a do značnej miery automatizuje. Vďaka tomu je možné znížiť čas získania výsledku na 4-5 hodín.
Účinnosť spôsobu PCR
Zemepisná šírka študovaného klinického materiálu
Ako vzorka s polymerázou reťazovej reakcie sa môže použiť nielen biologický materiál od pacienta, ale aj mnoho ďalších substrátov, v ktorých je možné identifikovať molekuly DNA s vysokou citlivosťou, napríklad vodu, pôdy, potraviny, mikroorganizmy, umývacie a oveľa viac.
Všetky uvedené výhody tejto jedinečnej metódy sú vysoká citlivosť a špecificita, identifikácia infekčného činidla a vykonávanie genotypizácie akéhokoľvek ľudského génu, vysokej účinnosti a času úspory, univerzálnosť palubnej dosky - umožňuje nám široko používať metódu PCR v klinickej diagnostike, Lekárska prax, vedecký výskum, kontrolné vlastnosti a mnoho ďalších oblastí.
PCR aplikácia
Aplikácie polymerázovej reťazovej reakcie ako moderného spôsobu molekulárnej biológie sú rôzne. V mnohých ohľadoch je to spôsobené zemepisnou šírkou materiálu, ktorý možno analyzovať (takmer všetko, z ktorých je možné identifikovať viac alebo menej kvalitnú DNA sa môže stať predmetom štúdie), ako aj vybrané priméry. Hlavné aplikácie PCR:
klinická medicína
- diagnóza infekčných chorôb
- diagnóza dedičných ochorení
- identifikovať mutácie
- genotypizácia
- bunkové technológie
- tvorba genetických pasov
ekológia
- monitorovanie životného prostredia
- analýza potravín
- analýza geneticky modifikovaných organizmov (GMO)
súdna medicína a kriminácia
- identifikácia osobnosti
- založenie otcovstva
farmakológia
veterinárny
vedecký výskum (molekulárna biológia, genetika)
Organizácia laboratória PCR.
Informácie na objednávku
| názov | Objem | Výroba | Metóda | Mačka |
|---|---|---|---|---|
Stránka poskytuje referenčné informácie len na oboznámenie sa. Diagnóza a liečba chorôb musia byť pod dohľadom špecialistu. Všetky lieky majú kontraindikácie. Konzultácie s odborníkom je povinné!
Metóda polymerická reťazová reakcia bol otvorený takmer tridsiatimi rokmi americkým vedcom pomenovaný Carrie Mulis. Technika je rozšírená v medicíne ako diagnostický nástroj, a jeho podstata spočíva v kopírovaní časti DNA pomocou špeciálneho enzýmu ( polymeráza) Umelý spôsob v testovacej trubici.V ktorých oblasti medicíny sa táto metóda aplikuje?
Aká je kópia DNA a ako to môže byť liek?Táto technika vám umožňuje:
- Vyberte a klonujte gény.
- Diagnostikovať genetické a infekčné ochorenia.
- Definovať otcovstvo. Dieťa čiastočne zdedí genetické vlastnosti z jeho biologických rodičov, má však svoju vlastnú jedinečnú genetickú identifikáciu. Má nejaké gény identické s rodičovskými génmi - umožňuje hovoriť o vytváraní príbuznosti.
Na mieste kriminality sa konanie zbiera vzorky genetických materiálov. Patrí medzi ne: vlasy, sliny, krv. Následne, vzhľadom na spôsob polymerázy reakcie, DNA môže byť amplifikovaná a porovnávacia identita vzorky s genetickým materiálom podozrivého.
Liek účinne používa reakciu polymerázovej reťazovej reakcie:
- V pulmonologickej praxi - na diferenciáciu bakteriálnych a vírusových druhov pneumónie, tuberkulózy.
- V gynekologickom a urologickej praxi - určiť ureaplamzzzu, chlamýdiu, mykoplazmu infekciu, gardnelózu, herpes, kvapavosti.
- V gastroenterologickej praxi.
- V hematológii - určiť infekciu onkovírusu a cytomegalovírusu.
- V rýchlej diagnóze takýchto infekčných chorôb ako vírusovej hepatitídy, diftheria, salmonelózy.
V súčasnosti je táto metóda najbežnejšia pri diagnostike infekčných ochorení ( vírusová etiológia hepatitídy, HIV, pohrebné ochorenia, tuberkulóza, kliešťová encefalitída).
Čo sa deje počas reakcie?
Samotná reakcia je chemicky jednoduchá. Zdroj DNA pre reakciu môže slúžiť ako kvapka krvi, vlasov, kus kože atď. Teoretická reakcia vyžaduje potrebné činidlá, testovaciu trubicu, vzorku biologického materiálu a zdroj tepla. Polymeráza reakcia vám umožňuje identifikovať infekciu, aj keď existuje iba jedna alebo viac molekúl DNA patogéru vo vzorke s biologickým materiálom.
Počas reakčného prietoku vďaka enzýmovi DNA polymerázy, zdvojnásobenie ( replikácia) DNA graf. Samotná kyselina deoxyribonukleová ( skrátená DNA) Je dôležité, aby sme zabezpečili skladovanie a prenos dcérskym bunkám genetických informácií. DNA má druh špirály, ktorý sa skladá z opakujúcich sa blokov. Tieto bloky tvoria nukleotidy, ktoré sú najmenšou DNA časticou. Nukleotidy sú vytvorené z aminokyselín.
Proces replikácie replikácie sekcií DNA sa vyskytuje počas opakovaných cyklov. Nielen pôvodný DNA fragment sa skopíruje do každého takého cyklu, ale sú skopírované tie fragmenty, ktoré sa už zdvojnásobili v minulosti amplifikačný cyklus. To všetko podobá procesu geometrického progresie.
Existuje:
- Prírodné zosilnenie ( to je proces kopírovania a chovu DNA), ku ktorej sa vyskytuje v našom tele a je deterministický, vopred určený proces.
- Umelé amplifikácie, ku ktorému dochádza v dôsledku polymerázovej reťazovej reakcie. V tomto prípade je proces kopírovania kontrolovaný a umožňuje zdvojnásobiť aj krátke oblasti nukleovej kyseliny.
Tridsaťdodrôtové cykly, počet fragmentov dosahuje niekoľko miliárd.
Pre amplifikáciu in vitro. (in vitro) Je potrebné, aby sa v biosariálnej podliehaní na diagnostiku, bol prítomný špecifický cudzie fragment DNA ( to znamená, že DNA nie je pacientom, ale kauzačným činidlom). Ak nie je v vytvorenom roztoku žiadny špecifický fragment - reťazová reakcia pod pôsobením polymerázy nebude ísť. To vysvetľuje skutočnosť vysokej špecifickosti PCR.
Štádiá PCR diagnostiky
1. Zo podľa študijného materiálu sa rozlišuje DNA.2. DNA sa pridá do špeciálneho roztoku z nukleotidov.
3. Roztok sa zahrieva na teplotu 90 - 95 stupňov Celzia, aby sa prevalil DNA proteín.
4. Znížte teplotu na 60 stupňov.
5. Pri znižovaní cyklov zvýšenia teploty sa zvyšuje počet rezov nukleových kyselín.
6. Vedením elektroforézy je výsledok zhrnutý a výsledky odpovedí sa vypočítajú.
Aké výhody majú túto diagnostiku?
- Univerzálnosť: Pre túto metódu sú vhodné všetky vzorky nukleovej kyseliny.
- Vysoká špecificita: Kauzačné činidlo má jedinečné sekvencie DNA reťazcov, ktoré sú pre neho charakteristické. Výsledky stráveného PCR budú preto spoľahlivé, nie je možné zamieňať gén jedného patogénu s genómom iného patogénu.
- Citlivosť na prítomnosť dokonca jediného kauzačného činidla molekuly.
- Malý materiál potrebný na výskum. Dokonca aj pokles krvi je vhodná. Schopnosť získať výsledok, s použitím minimálneho objemu vzorky, je veľmi dôležitý pre pediatrické, neonatologické, neurologické štúdie, ako aj v praxi forenznej medicíny.
- Možnosť určenia pomaly, chronickej infekcie a nielen akútne.
- Mnohé patogénne kultúry sú veľmi ťažké kultivovať v testovacej trubici s inými technikami a polymerázová reakcia umožňuje znásobujúcu kultúru v požadovanom množstve.
Aké nevýhody má túto diagnózu?
- Ak je DNA nie je len živým patogénom, ale aj zosnulý - amplifikácia oboch DNA sa vyskytne v materiáli na vedenie PCR. V súlade s tým môže byť liečba po diagnóze vymenovaná nie je úplne správna. Po určitom čase je lepšie podstúpiť kontrolu nad účinnosťou liečby.
- Zvýšená citlivosť na prítomnosť mikroorganizmov môže byť tiež zvážená, v určitým spôsobom, nevýhoda. Kondicionálna patogénna mikroflóra je prítomná v ľudskom tele, to znamená, že sú to mikroorganizmy, ktoré žijú v črevách, žalúdku, iných vnútorných orgánoch. Tieto mikroorganizmy môžu spôsobiť škodu človeku len za určitých nepriaznivých podmienok - nedodržania hygienických požiadaviek, kontaminovanej pitnej vody atď. PCR technika zosilňuje DNA aj týchto mikroorganizmov, hoci nevedú k patológii.
- PCR rôznych testovacích systémov môže vykazovať výsledky, ktoré budú navzájom zlomené. Existuje mnoho modifikácií tejto techniky: " vnorený», « asymetrický», « obrátený», « kvantitatívny»PCR a ďalšie.