/ 16
Najhorší Najlepšie
Testovanie na infekciu HIV podlieha:
2. Osoby s podozrením alebo potvrdenou diagnózou: bakteriálna infekcia u detí do 13 rokov, mnohopočetná a recidivujúca; kandidóza pažeráka, priedušnice, priedušiek alebo pľúc; invazívna rakovina krčka maternice; diseminovaná alebo extrapulmonárna kokcidioidomykóza; extrapulmonálna kryptokokóza; kryptosporidióza s hnačkou počas 1 mesiaca alebo dlhšie; cytomegalovírusové lézie iných orgánov, s výnimkou pečene, sleziny, lymfatických uzlín u pacientov starších ako 1 mesiac; cytomegalovírusová retinitída so stratou zraku; herpetická infekcia spôsobujúca multifokálne vredy, ktoré sa nezahoja do 1 mesiaca, alebo bronchitída, zápal pľúc, ezofagitída; diseminovaná alebo extrapulmonárna histoplazmóza; izosporóza s hnačkou dlhšie ako 1 mesiac; rozšírená alebo extrapulmonárna tuberkulóza; pľúcna tuberkulóza u dospelých alebo dospievajúcich starších ako 13 rokov; extrapulmonálna tuberkulóza; iné ochorenie spôsobené mykobaktériami inými ako M. tuberculosis diseminované alebo extrapulmonárne; pneumónia spôsobená pneumocystami; progresívna multifokálna leukoencefalopatia; salmonela (okrem Salmonella typhi) septikémia, opakujúca sa; toxoyláza-mozaika mozgu u detí starších ako 1 mesiac; Kaposiho sarkómy; lymfoidná intersticiálna pneumónia u detí mladších ako 13 rokov; Burkittov lymfóm; imunoblastický lymfóm; primárny mozgový lymfóm; syndróm chradnutia, hepatitída B, nosičstvo HBsAg; infekčná mononukleóza; opakujúci sa herpes zoster u ľudí starších ako 60 rokov; pohlavne prenosné choroby.
Vysoko špecializované laboratórium vykonáva:
a) stanovenie protilátok, antigénov a imunitných komplexov cirkulujúcich v krvi; kultivácia vírusu, identifikácia jeho genómového materiálu a enzýmov;
b) hodnotenie funkcií bunkového spojenia imunitného systému. Hlavná úloha patrí metódam sérologickej diagnostiky zameranej na stanovenie protilátok, ako aj antigénov patogénu v krvi a iných biologických tekutinách tela.
Testovanie protilátok proti HIV sa vykonáva s cieľom:
a) bezpečnosť krvných transfúzií a transplantácií;
b) dohľad, testovanie s cieľom monitorovať prevalenciu infekcie HIV a študovať dynamiku jej prevalencie v určitej populácii;
c) diagnostika infekcie HIV, t. j. dobrovoľné testovanie krvného séra prakticky zdravých ľudí alebo pacientov s rôznymi klinickými príznakmi a symptómami podobnými infekcii HIV alebo AIDS.
Systém laboratórnej diagnostiky HIV infekcie je vybudovaný na trojstupňovom princípe. Prvá etapa - skríning, je určená na vykonávanie primárnych krvných testov na prítomnosť protilátok proti proteínom HIV. Druhý stupeň je referenčný - umožňuje pomocou špeciálnych metodických techník objasniť (potvrdiť) primárny pozitívny výsledok získaný v štádiu skríningu. Tretí etán - expertný je určený na konečné overenie prítomnosti a špecifickosti markerov infekcie HIV identifikovaných v predchádzajúcich štádiách laboratórnej diagnostiky. Potreba niekoľkých stupňov laboratórnej diagnostiky je primárne spôsobená ekonomickými úvahami.
V praxi sa používa niekoľko testov, ktoré umožňujú identifikovať HIV infikovaných s dostatočnou mierou spoľahlivosti:
ELISA (ELISA) -test (enzyme-linked immunosorbent assay) detekcia prvej úrovne sa vyznačuje vysokou citlivosťou, aj keď menej špecifickou ako nasledujúce;
Immune blot (Western-blot), veľmi špecifický a najpoužívanejší test na rozlíšenie medzi HIV-1 a HIV-2;
P25 test antigenémie, účinný v počiatočných štádiách infekcie;
Polymerázová reťazová reakcia (PCR).
V prípade hromadného skríningu vzoriek krvi sa odporúča testovať zmesi sér zo skupiny subjektov zostavené tak, aby výsledné riedenie každej vzorky nepresiahlo 1:100. Ak je zmes séra a prúdu pozitívna, testuje sa každá pozitívna zmes séra. Táto metóda nevedie k strate citlivosti tak pri ELISA, ako aj pri imunoblote, ale znižuje mzdové náklady a náklady na vstupné vyšetrenie o 60 – 80 %.
V primárnej sérodiagnostike HIV infekcie sa celkové protilátky stanovujú pomocou skríningových skríningových testov – ELISA a aglutinačných reakcií. V druhom (arbitrážnom) štádiu sa používa zložitejší test - imunoblot, ktorý umožňuje nielen potvrdiť alebo zamietnuť počiatočný záver, ale aj na úrovni stanovenia protilátok proti jednotlivým vírusovým proteínom.
Prepojený imunosorbentový test(ELISA) je hlavná a najpoužívanejšia metóda na stanovenie protilátok proti HIV. Nevýhody použitia ELISA pri sérodiagnostike infekcie HIV však zahŕňajú časté falošne pozitívne výsledky. V tomto ohľade nie je výsledok v ELISA základom pre záver o HIV séropozitivite subjektu. Je to spôsobené nedostatočným čistením imunosorbentu od balastných proteínov; spontánna väzba sérových protilátok na plast, ak jeho oblasti neobsadené imunosorbentom sú nedostatočne blokované alebo nie sú blokované úplne špeciálnym neutrálnym proteínom; skrížená interakcia s HIV proteínmi imunosorbentu rôznych proteínov prítomných v krvi osôb s určitými, častejšie autoimunitnými patologickými procesmi, ako je roztrúsená skleróza, SLE, tuberkulóza; s častým darcovstvom, infekčnými a onkologickými ochoreniami, popáleninami, tehotenstvom, opakovanými krvnými transfúziami, transplantáciami orgánov a tkanív, ako aj ľudia na hemodialýze; s prítomnosťou reumatoidného faktora v krvi, čo často vyvoláva falošne pozitívne reakcie HIV; prítomnosť protilátok proti gag-proteínom HIV a predovšetkým proti proteínu p24 v krvi vyšetrovaných osôb (samozrejme sa tvoria protilátky proti exo- alebo endogénnym, zatiaľ neidentifikovaným retrovírusom). Pretože anti-p24 je syntetizovaný bezchybne v skorých štádiách sérokonverzie HIV, uskutočňuje sa ďalšie imunologické pozorovanie osôb s protilátkami proti HIV gag proteínom, ako aj ich odstránenie z darcovstva.
Citlivosť a špecifickosť enzýmovej imunoanalýzy sa neustále zvyšuje. Výsledkom je, že štvrtá generácia ELISA nie je vo svojich diagnostických schopnostiach nižšia ako imunitný blotting a môže sa použiť nielen pri skríningu, ale aj v konfirmačnej fáze diagnostiky infekcie HIV [Smolskaya T. T., 1997].
Imunoblotting je konečná metóda sérologickej diagnostiky, ktorá umožňuje urobiť konečný záver o HIV pozitivite alebo negativite subjektu.
Medzi výsledkami štúdie sér v imunoblote a ELISA je jasná korelácia - dvakrát pozitívne v ELISA s rôznymi testovacími systémami, séra v 97-98% prípadov sa potom ukážu ako HIV pozitívne pri imunoblote. Ak boli séra pozitívne v ELISA len v jednom z dvoch použitých testovacích systémov, pri imunoblote sú pozitívne len v 4 % prípadov. V 5 % prípadov pri vykonávaní potvrdzujúcich štúdií u osôb s pozitívnymi údajmi môže ELISA-imunoblot poskytnúť „neurčité“ výsledky a medzi nimi približne v 20 % prípadov „neurčité“ výsledky spôsobujú protilátky proti gag proteínom HIV-1 ( p55, p25, p18). Prítomnosť protilátok len proti gag proteínom HIV-1 je dôvodom na dodatočné vyšetrenie krvného séra na infekciu HIV-2.
Vyhodnotenie výsledkov imunoblotovania sa vykonáva striktne v súlade s pokynmi pripojenými k testovaciemu systému. Ak v pokynoch nie sú uvedené pokyny na interpretáciu výsledkov, mali by sa použiť kritériá WHO.
Po prijatí pozitívnych výsledkov štúdií v referenčnom štádiu laboratórnej diagnostiky infekcie HIV a negatívneho výsledku štúdie metódou imunitného prenosu sa 6 mesiacov po prvom vyšetrení vykoná povinná opakovaná odborná diagnostika.
Ak výsledky imunoblottingu 12 mesiacov po štúdii prvej vzorky zostanú negatívne alebo neisté, potom pri absencii rizikových faktorov, klinických symptómov alebo iných faktorov spojených s infekciou HIV sa subjekt vyradí z dispenzárneho pozorovania.
Zo sérologických metód sa v prípade neistých výsledkov používa ako odborná diagnóza imunoblot. rádioimunoprecipitácia(RIP). Je založená na použití vírusových proteínov značených rádioaktívnym jódom a zrazeniny sa detegujú pomocou beta čítačov. Nevýhody tejto metódy zahŕňajú vysoké náklady na vybavenie, potrebu vybavenia na tieto účely v špeciálnych miestnostiach.
Osoby s diagnózou HIV infekcie podliehajú neustálemu dynamickému pozorovaniu s povinným laboratórnym vyšetrením každých 6 mesiacov.
Polymerázová reťazová reakcia (PCR) deteguje vopred namnožené nukleotidové sekvencie špecifické pre genóm daného patogénu. Izolované množenie génu alebo jeho fragmentu, nazývané amplifikácia, PCR umožňuje uskutočniť v skúmavke pomocou enzýmu termostabilnej DNA polymerázy. Za 2-3 hodiny vám PCR umožňuje získať milióny kópií konkrétnej oblasti vírusu. Pri infekcii HIV sa z bunkovej RNA vrátane RNA vírusu, ak bola reprodukovaná v bunke alebo bola integrovaná do jej genómu, získa dostatočné množstvo provírusovej DNA reverznou transkripciou a hybridizáciou so značenými oligonukleotidovými „sondami“. "na analýzu, ktorá sa zisťuje a kvantifikuje, ako aj vo vzťahu k príslušnosti ku genómu HIV, rádioaktívnym alebo iným značením sondy, čím sa stanovuje homológia DNA a vírusovo špecifických aminokyselinových sekvencií. Citlivosť PCR je detekcia vírusových génov v jednej z päťtisíc buniek.
PCR, vrátane kvantitatívnej, sa môže použiť len na stanovenie vírusovej záťaže v plazme, aby sa vyriešil problém začatia medikamentóznej liečby pacienta alebo zmeny antiretrovírusových liekov. PCR nemožno odporučiť na diagnostiku infekcie HIV, pretože aj najmodernejšie metódy jej vyjadrenia a činidiel umožňujú určiť vírusovú záťaž nie nižšiu ako určitá úroveň - 50 kópií / ml. A zložitosť testovania PCR a jeho vysoké náklady (približne 200 dolárov) negujú jeho široké použitie ako metódy dennej laboratórnej diagnostiky infekcie HIV. PCR teda zostáva nepostrádateľná len na hodnotenie vírusovej záťaže v plazme u pacientov s už stanovenou diagnózou HIV infekcie, aby sa vyriešil problém liečby pacienta.
Štádiá laboratórnej diagnostiky HIV infekcie sú schematicky znázornené na obr. jeden.
Ryža. 1. Etapy laboratórnej diagnostiky HIV infekcie
Počas HIV infekcie nastáva obdobie „tmavého laboratórneho okna“, kedy množstvo protilátok proti HIV nestačí na citlivosť testovacích systémov. Toto obdobie sa pohybuje od jedného týždňa do troch mesiacov od okamihu infekcie HIV v závislosti od úrovne citlivosti testovacieho systému. S prihliadnutím na tento jav vznikajú ťažkosti pri vyšetrovaní darovanej krvi od osôb, ktoré sú v uvedenom období HIV infekcie. Preto je vo väčšine krajín sveta zavedený systém používania krvi až po jej skladovaní 3-6 mesiacov, aby sa u darcov týchto dávok krvi a jej darcov vykonalo povinné opätovné vyšetrenie na HIV infekciu. komponentov.
Štádium primárnych prejavov je charakterizované aktivitou replikačného procesu. Výsledná virémia a antigenémia spôsobujú tvorbu špecifických protilátok triedy IgM: anti-p24, anti-gp41, anti-gp120. Antigén p24 u niektorých infikovaných môže byť detekovaný v krvi testom ELISA už 2 týždne po infekcii a stanovený až 8 týždňov. Ďalej v klinickom priebehu infekcie HIV dochádza k druhému zvýšeniu obsahu proteínu p24 v krvi, ku ktorému dochádza počas formovania štádia AIDS.
Výskyt úplnej sérokonverzie, keď je v periférnej krvi zaznamenaná vysoká hladina špecifických IgG protilátok proti štrukturálnym proteínom HIV gp41, p24, gpl20, výrazne uľahčuje diagnostiku infekcie HIV. Väčšina komerčných súprav je navrhnutá tak, aby indikovala práve takéto protilátky.
Ťažkosti pri detekcii protilátok u pacientov s infekciou HIV môžu nastať v obdobiach masívnej virémie a antigenémie, keď sa dostupné špecifické protilátky v krvi vynakladajú na viazanie vírusových častíc a replikačný proces predstihuje produkciu nových antivírusových protilátok.
U jedincov s pôvodne oslabeným imunitným systémom sa virémia a antigenémia objavia skôr a zostávajú na vysokej úrovni až do výsledku ochorenia. Takíto pacienti majú zároveň nízky obsah voľných protilátok proti HIV, a to z dvoch dôvodov – nedostatočná tvorba protilátok B-lymfocytmi a väzba viriónov a rozpustných HIV proteínov protilátkami, preto na stanovenie infekcie testujú systémy s je potrebná zvýšená citlivosť alebo modifikácie analytických metód.krok uvoľňovania protilátok z imunitných komplexov.
Napriek množstvu špecifických markerov infekcie HIV sa najčastejšie určuje prítomnosť celkových protilátok proti proteínom HIV. Výraz "celkový" znamená prítomnosť dvoch tried protilátok (IgG a IgM) a širokého spektra protilátok proti rôznym, primárne štrukturálnym, HIV proteínom.
Stanovenie buniek CD4. Hlavným klinickým a laboratórnym ukazovateľom na diagnostiku štádia infekcie HIV, stupňa deštrukcie imunitného systému u pacientov v každodennom živote bolo stanovenie obsahu CD4 + lymfocytov: pokles hladiny pod 200 buniek / mm3 je hlavné kritérium diagnostiky AIDS. Predpokladá sa, že všetci jedinci infikovaní HIV s počtom CD4+ lymfocytov 200 buniek/mm3 a nižším potrebujú antivírusovú terapiu aj prevenciu pneumónie spôsobenej Pneumocystis. A hoci 1/3 HIV-infikovaných s počtom C04+ lymfocytov nižším ako 200 buniek/mm3 nemá žiadne klinické prejavy, skúsenosti ukázali, že sa u nich rozvinú symptómy v priebehu nasledujúcich 2 mesiacov, takže všetci sú považovaní za pacientov s AIDS.
V súčasnosti nové diagnostické technológie umožňujú identifikovať etiologické a patogenetické príčiny mnohých ochorení a radikálne ovplyvniť výsledky liečby. Azda najpôsobivejšie výsledky zavádzania týchto technológií do klinickej praxe sa dosiahli v oblasti imunológie a diagnostiky infekčných chorôb.
Testovacie systémy založené na enzýmovej imunoanalýze a imunochemiluminiscenčnej analýze umožňujú detekciu protilátok rôznych tried, čo výrazne zvyšuje informačný obsah metód klinickej, analytickej citlivosti a špecifickosti pre diagnostiku infekčných ochorení. Je potrebné poznamenať, že najvýznamnejšie pokroky v diagnostike infekcií sú spojené so zavedením metódy polymerázovej reťazovej reakcie do laboratórnej praxe, ktorá je považovaná za „zlatý štandard“ v diagnostike a hodnotení účinnosti liečby ochorenia. počet infekčných chorôb.
Na výskum možno použiť rôzny biologický materiál: sérum, krvnú plazmu, škrabanie, biopsiu, pleurálny alebo cerebrospinálny mok (CSF). V prvom rade sú metódy laboratórnej diagnostiky infekcií zamerané na identifikáciu takých chorôb, ako je vírusová hepatitída B, C, D, cytomegalovírusová infekcia, sexuálne prenosné infekcie (kvapavka, chlamýdiá, mykoplazma, ureaplazma), tuberkulóza, infekcia HIV atď.
Infekcia HIV je ochorenie spôsobené vírusom ľudskej imunodeficiencie (HIV), ktorý dlhodobo pretrváva v lymfocytoch, makrofágoch, bunkách nervového tkaniva, čo vedie k pomaly progresívnemu poškodeniu imunitného a nervového systému tela, ktoré sa prejavuje sekundárnymi infekcie, nádory, subakútna encefalitída a iné patologické zmeny.
Pôvodcovia infekcie - vírusy ľudskej imunodeficiencie 1. a 2. typu (HIV-1, HIV-2) - patria do rodiny retrovírusov, podrodiny pomalých vírusov. Virióny sú sférické častice s priemerom 100-140 nm. Vírusová častica má vonkajší fosfolipidový obal obsahujúci glykoproteíny (štrukturálne proteíny) s určitou molekulovou hmotnosťou, meranou v kilodaltonoch. V HIV-1 sú to gpl60, gpl20, gp41. Vnútorný obal vírusu pokrývajúci jadro predstavujú aj proteíny so známou molekulovou hmotnosťou - p17, p24, p55 (HIV-2 obsahuje gpl40, gpl05, gp36, p16, p25, p55).
Genóm HIV zahŕňa RNA a enzým reverznej transkriptázy (reverzná transkriptáza). Aby sa genóm retrovírusu spojil s genómom hostiteľskej bunky, DNA sa najskôr syntetizuje na vírusovej RNA templáte pomocou reverznej transkriptázy. Potom sa provírusová DNA vloží do genómu hostiteľskej bunky. HIV má výraznú antigénnu variabilitu, ktorá je výrazne vyššia ako u vírusu chrípky.
V ľudskom tele sú hlavným cieľom HIV T-lymfocyty, ktoré nesú na povrchu najväčší počet CD4 receptorov. Po preniknutí HIV do bunky pomocou revertázy podľa vzoru svojej RNA vírus syntetizuje DNA, ktorá je integrovaná do genetického aparátu hostiteľskej bunky (CD4 lymfocyty) a zostáva tam po celý život v provírusovom stave. Okrem T-pomocných lymfocytov sú postihnuté makrofágy, B-lymfocyty, neurogliové bunky, črevná sliznica a niektoré ďalšie bunky. Dôvodom poklesu počtu T-lymfocytov (CD4 buniek) je nielen priamy cytopatický účinok vírusu, ale aj ich fúzia s neinfikovanými bunkami. Spolu s porážkou T-lymfocytov u pacientov s infekciou HIV dochádza k polyklonálnej aktivácii B-lymfocytov so zvýšením syntézy imunoglobulínov všetkých tried, najmä IgG a IgA a následnému vyčerpaniu tejto časti imunitného systému. systém. Zhoršená regulácia imunitných procesov sa prejavuje aj zvýšením hladiny α-interferónu, β2-mikroglobulínu a znížením hladiny IL-2. V dôsledku dysfunkcie imunitného systému, najmä pri poklese počtu T-lymfocytov (CD4) na 400 buniek v 1 μl krvi alebo menej, vznikajú podmienky pre nekontrolovanú replikáciu HIV s výrazným zvýšením počtu viriónov v rôznych prostrediach tela. V dôsledku porážky mnohých častí imunitného systému sa osoba infikovaná HIV stáva bezbrannou voči patogénom rôznych infekcií.
Na pozadí zvyšujúcej sa imunosupresie vznikajú ťažké progresívne ochorenia, ktoré sa u človeka s normálne fungujúcim imunitným systémom nevyskytujú. Ide o choroby, ktoré Svetová zdravotnícka organizácia (WHO) definovala ako markerové alebo indikátorové choroby AIDS.
Choroby indikátora AIDS
Prvá skupina - choroby spojené len s ťažkou imunodeficienciou (CD4<200). Клинический диагноз ставится при отсутствии анти-ВИЧ-антител или ВИЧ-антигенов.
Druhá skupina - choroby, ktoré sa môžu vyvinúť na pozadí ťažkej imunodeficiencie av niektorých prípadoch aj bez nej.
Preto je v týchto prípadoch nevyhnutné laboratórne potvrdenie diagnózy.
Prvá skupina:
- kandidóza pažeráka, priedušnice, priedušiek;
- extrapulmonálna kryptokokóza;
- kryptosporidióza s hnačkou dlhšie ako 1 mesiac;
- cytomegalovírusové lézie rôznych orgánov iných ako pečeň, slezina alebo lymfatické uzliny u pacienta staršieho ako 1 mesiac;
- infekcia spôsobená vírusom herpes simplex, ktorá sa prejavuje vredmi na koži a sliznici, ktoré pretrvávajú dlhšie ako 1 mesiac, ako aj bronchitídou, zápalom pľúc alebo ezofagitídy akéhokoľvek trvania, ktorá postihuje pacienta staršieho ako 1 mesiac;
- generalizovaný Kaposiho sarkóm u pacientov mladších ako 60 rokov;
- cerebrálny lymfóm (primárny) u pacientov mladších ako 60 rokov;
- lymfocytárna intersticiálna pneumónia a / alebo pľúcna lymfoidná dysplázia u detí mladších ako 12 rokov;
- diseminovaná infekcia spôsobená atypickými mykobaktériami (mycobacterium complex M. aviumintracellulare) s extrapulmonárnou lokalizáciou alebo lokalizáciou (okrem pľúc) v koži, krčných lymfatických uzlinách, lymfatických uzlinách koreňov pľúc;
- pneumocystovej pneumónie;
- progresívna multifokálna leukoencefalopatia;
- toxoplazmóza mozgu u pacientov starších ako 1 mesiac.
Druhá skupina:
- bakteriálne infekcie, kombinované alebo recidivujúce, u detí do 13 rokov (viac ako dva prípady za 2 roky pozorovania): sepsa, zápal pľúc, meningitída, poškodenie kostí alebo kĺbov, abscesy spôsobené hemofilnými tyčinkami, streptokoky;
- diseminovaná kokcidioidomykóza (mimopulmonálna lokalizácia);
- HIV encefalopatia (demencia HIV, demencia AIDS);
- histoplazmóza s pretrvávajúcou hnačkou dlhšie ako 1 mesiac;
- izosporóza s pretrvávajúcou hnačkou dlhšie ako 1 mesiac;
- Kaposiho sarkóm v akomkoľvek veku;
- lymfóm mozgu (primárny) u osôb akéhokoľvek veku;
- iné B-bunkové lymfómy (s výnimkou Hodgkinovej choroby) alebo lymfómy neznámeho imunofenotypu: malobunkové lymfómy (ako je Burkittov lymfóm atď.); imunoblastické sarkómy (lymfómy imunoblastické, veľkobunkové, difúzne histiocytárne, difúzne nediferencované);
- diseminovaná mykobakterióza (nie tuberkulóza) s léziami okrem pľúc na koži, krčných alebo hilárnych lymfatických uzlinách;
- extrapulmonálna tuberkulóza (s poškodením vnútorných orgánov, okrem pľúc);
- salmonelová septikémia, opakujúca sa;
- HIV dystrofia (vyčerpanie, dramatický úbytok hmotnosti).
Tabuľka 1 (pozri zdrojový odkaz vyššie) uvádza choroby definujúce AIDS a ich etiologické agens.
Existuje mnoho klasifikácií AIDS.
Podľa novej klasifikácie navrhnutej Centrom pre kontrolu chorôb v USA (tabuľka 2 - pozri zdrojový odkaz vyššie), diagnóza AIDS je stanovená u osôb s počtom buniek CD4 nižším ako 200 / μl, a to aj v prípade neprítomnosti AIDS. - definovanie chorôb.
Do kategórie B patria rôzne syndrómy, z ktorých najvýznamnejšie sú bacilárna angiomatóza, orofaryngeálna kandidóza, recidivujúca vulvovaginálna kandidóza, ťažko liečiteľná, cervikálna dysplázia, cervikálny karcinóm, idiopatická trombocytopenická purpura, listerióza, periférna neuropatia.
Protilátky proti HIV-1 a HIV-2 v krvi
Protilátky proti HIV-1 a HIV-2 normálne v krvnom sére chýbajú.
Stanovenie protilátok proti HIV je hlavnou metódou laboratórnej diagnostiky infekcie HIV. Metóda je založená na ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) - senzitivita je viac ako 99,5 %, špecificita je viac ako 99,8 %. Protilátky proti HIV sa objavia u 90-95% infikovaných do 1 mesiaca po infekcii, u 5-9% - po 6 mesiacoch, u 0,5-1% - neskôr. V štádiu AIDS sa môže počet protilátok znižovať, až kým úplne nezmiznú.
Výsledok výskumu je vyjadrený kvalitatívne: pozitívne alebo negatívne.
Negatívny výsledok testu naznačuje neprítomnosť protilátok proti HIV-1 a HIV-2 v krvnom sére. Laboratórium vydá negatívny výsledok ihneď po svojej pripravenosti. Po prijatí pozitívneho výsledku - detekcia protilátok proti HIV - aby sa predišlo falošne pozitívnym výsledkom v laboratóriu, analýza sa opakuje ešte 2 krát.
Imunoblotting na protilátky proti vírusovým proteínom HIV v krvnom sére
Protilátky proti vírusovým proteínom HIV v krvnom sére normálne chýbajú.
Metóda ELISA na stanovenie protilátok proti HIV je skríningová metóda. Keď sa získa pozitívny výsledok, na potvrdenie jeho špecifickosti sa použije metóda imunoblotovania - Western-blot - protizrážanie v géli protilátok v krvnom sére pacienta s rôznymi vírusovými proteínmi oddelenými podľa molekulovej hmotnosti pomocou elektroforézy a aplikovanými na nitrocelulózu. Stanovia sa protilátky proti vírusovým proteínom gp41, gpl20, gpl60, p24, pi8, p17 atď.
Podľa odporúčaní Ruského centra pre prevenciu a kontrolu AIDS treba za pozitívny výsledok považovať detekciu protilátok proti jednému z glykoproteínov gp41, gpl20, gpl60. Ak sa zistia protilátky proti iným proteínom vírusu, výsledok sa považuje za pochybný, takýto pacient by mal byť vyšetrený dvakrát - po 3 a 6 mesiacoch.
Neprítomnosť protilátok proti špecifickým HIV proteínom znamená, že enzýmová imunoanalýza poskytla falošne pozitívny výsledok. Zároveň je pri praktickej práci pri vyhodnocovaní výsledkov metódy Western blotting potrebné riadiť sa návodom dodávaným firmou k použitej „Kit for Western blotting“.
Na laboratórnu diagnostiku infekcie HIV sa používa metóda imunoblotovania.
Antigén P24 v sére
Antigén p24 normálne chýba v krvnom sére.
Antigén p24 je proteín nukleotidovej steny HIV. Štádium primárnych prejavov po infekcii HIV je dôsledkom nástupu replikačného procesu. Antigén p24 sa objavuje v krvi 2 týždne po infekcii a môže byť detekovaný testom ELISA v období od 2 do 8 týždňov. Po 2 mesiacoch od okamihu infekcie antigén p24 z krvi zmizne. Neskôr, v klinickom priebehu infekcie HIV, sa zaznamená druhé zvýšenie obsahu proteínu p24 v krvi. Pripadá na obdobie vzniku AIDS. Existujúce testovacie systémy ELISA na detekciu antigénu p24 sa používajú na včasnú detekciu HIV u darcov krvi a detí, na stanovenie prognózy priebehu AIDS a na monitorovanie terapie u pacientov s AIDS. ELISA má vysokú analytickú citlivosť, ktorá umožňuje detekciu antigénu HIV-1 p24 v sére v koncentrácii 5-10 pkg / ml a HIV-2 - menej ako 0,5 ng / ml a špecifickosť. Je však potrebné poznamenať, že hladina antigénu p24 v krvi podlieha individuálnym odchýlkam, čo znamená, že iba 20 – 30 % pacientov je možné pomocou tejto štúdie detegovať v skorom období po infekcii (Rose NR et al., 1997).
Protilátky proti antigénu p24 triedy IgM a IgG v krvi sa objavujú od 2. týždňa, dosahujú maximum v priebehu 2-4 týždňov a zostávajú na tejto úrovni rôzne dlho: IgM protilátky - niekoľko mesiacov, vymiznú do jedného roka po infekcii a IgG protilátky môžu trvať roky.
Algoritmus diagnostiky HIV infekcie závisí od fázy ochorenia a je charakterizovaný zmenou dynamiky detekcie protilátok rôznych tried (obr. 1, 2 - pozri odkaz na zdroj vyššie).
Výsledok výskumu je vyjadrený kvalitatívne – pozitívne alebo negatívne. Negatívny výsledok testu naznačuje neprítomnosť protilátok proti HIV-1 a HIV-2 a antigénu p24 v krvnom sére.
Laboratórium vydá negatívny výsledok ihneď po svojej pripravenosti. Po prijatí pozitívneho výsledku - detekcia protilátok proti HIV-1 a HIV-2 a / alebo antigénu p24 - aby sa predišlo falošne pozitívnym výsledkom v laboratóriu, analýza sa opakuje ešte 2 krát.
Bez ohľadu na získané výsledky testov odošle laboratórium vzorku krvi pacienta a výsledky 3 testov do regionálneho centra AIDS na potvrdenie pozitívneho výsledku alebo na overenie nedefinovaného výsledku. V takýchto prípadoch poskytne Regionálne centrum AIDS konečnú odpoveď pre tento prieskum.
Detekcia HIV pomocou polymerázovej reťazovej reakcie (kvalitatívne)
Detekcia HIV pomocou polymerázovej reťazovej reakcie - PCR (kvalitatívne) sa vykonáva s cieľom:
- riešenie sporných výsledkov štúdií imunoblotovania;
- na včasnú diagnostiku infekcie HIV;
- sledovanie účinnosti antivírusovej liečby;
- určenie štádia ochorenia AIDS (prechod infekcie do choroby).
V prípade primárnej infekcie HIV umožňuje metóda PCR detekciu HIV RNA v krvi už 10-14 dní po infekcii.
Výsledok výskumu je vyjadrený kvalitatívne: pozitívne alebo negatívne. Negatívny výsledok testu naznačuje neprítomnosť HIV RNA v krvi.
Pozitívny výsledok - detekcia HIV RNA - naznačuje, že pacient je infikovaný.
Detekcia HIV pomocou polymerázovej reťazovej reakcie (kvantitatívna)
HIV normálne chýba v krvi.
Priama kvantifikácia HIV RNA pomocou PCR umožňuje presnejšie ako stanovenie obsahu CD4 buniek predpovedať rýchlosť rozvoja AIDS u ľudí infikovaných HIV, teda presnejšie posúdiť ich prežitie. Vysoký počet vírusových častíc zvyčajne koreluje s ťažkou poruchou imunitného stavu a nízkym počtom buniek CD4. Nízky počet vírusových častíc vo všeobecnosti koreluje s lepším imunitným stavom a vyšším počtom buniek CD4. Obsah vírusovej RNA v krvi môže predpovedať prechod ochorenia do klinického štádia. Keď je obsah HIV RNA-1 > 74 100 kópií/ml, takmer u všetkých pacientov sa vyvinie klinický obraz AIDS (Senior D., Holden E., 1996).
Jedinci s hladinami HIV-1 v krvi > 10 000 kópií/ml majú 10,8-krát vyššiu pravdepodobnosť, že sa u nich rozvinie AIDS, ako u osôb s hladinami HIV-1 v krvi<10 000 копий/мл. При ВИЧ-инфекции прогноз непосредственно определяется уровнем виремии. Снижение уровня виремии при лечении улучшает прогноз заболевания.
Indikáciu na liečbu pacientov s HIV vyvinula skupina amerických expertov. Liečba je indikovaná u pacientov s krvným počtom buniek CD4<300/мкл или уровнем РНК ВИЧ в сыворотке >20 000 kópií / ml (PCR). Hodnotenie výsledkov antiretrovírusovej terapie u osôb infikovaných HIV sa uskutočňuje znížením hladiny sérovej RNA HIV.
Pri účinnej liečbe by sa úroveň virémie mala počas prvých 8 týždňov znížiť 10-násobne a mala by byť pod detekčným limitom metódy (PCR) (<500 копий/мл) через 4-6 месяцев после начала терапии.
Dodnes sa teda zaviedlo a v klinickej praxi používa mnoho výskumných metód na diagnostiku infekcie HIV, ako aj na všetky ostatné vírusové infekcie. Medzi nimi vedúcu úlohu zohráva sérologický výskum. Hlavné metódy diagnostiky HIV infekcií sú uvedené v tabuľke 3 (pozri odkaz na zdroj vyššie), kde sú rozdelené podľa dôležitosti jednotlivých metód na detekciu vírusov do štyroch úrovní:
- A - test sa zvyčajne používa na potvrdenie diagnózy;
- B - test je za určitých okolností užitočný na diagnostiku určitých foriem infekcie;
- C - test sa zriedka používa na diagnostické účely, ale má veľký význam pre epidemiologické prieskumy;
- D - test zvyčajne nepoužívajú laboratóriá na diagnostické účely.
Keďže pre diagnostiku vírusových infekcií je okrem výberu optimálnej metódy analýzy nemenej dôležité správne identifikovať a odobrať biomateriál na výskum, tabuľka 4 (pozri odkaz na zdroj vyššie) poskytuje odporúčania na výber optimálneho biomateriálu na výskum HIV infekcie.
Na sledovanie HIV infikovaných je potrebné využiť možnosti komplexnej štúdie imunitného stavu - kvantitatívne a funkčné stanovenie všetkých jeho väzieb: humorálnej, bunkovej imunity a nešpecifickej rezistencie vo všeobecnosti.
V moderných laboratórnych podmienkach viacstupňový princíp hodnotenia imunologického stavu zahŕňa stanovenie subpopulácie lymfocytov, krvných imunoglobulínov. Pri hodnotení ukazovateľov treba mať na pamäti, že infekcia HIV je charakterizovaná poklesom pomeru CD4 / CD8 T buniek menej ako 1. CD4 / CD8 index 1,5-2,5 označuje normálny stav, viac ako 2,5 hyperaktivitu , menej 1,0 - naznačuje imunodeficienciu. Pomer CD4/CD8 môže byť tiež menší ako 1 pri ťažkom zápale.
Tento pomer má zásadný význam pri hodnotení imunitného systému u pacientov s AIDS, pretože HIV selektívne infikuje a ničí CD4 lymfocyty, v dôsledku čoho pomer CD4/CD8 klesá na hodnoty výrazne nižšie ako 1.
Pri hodnotení imunologického stavu sa vychádza aj z identifikácie celkových alebo „hrubých“ defektov v systéme bunkovej a humorálnej imunity: hypergamaglobulinémia (zvýšená koncentrácia IgA, IgM, IgG) alebo hypogamaglobulinémia v terminálnom štádiu; zvýšenie koncentrácie cirkulujúcich imunitných komplexov; znížená produkcia cytokínov; oslabenie odpovede lymfocytov na antigény a mitogény.
Porušenie pomeru populácií v celkovom súbore B-lymfocytov je charakteristické pre nedostatočnú humorálnu imunitu. Tieto zmeny sú však nešpecifické pre infekciu HIV a môžu sa vyskytnúť aj pri iných ochoreniach. Pri komplexnom hodnotení množstva ďalších laboratórnych parametrov je potrebné mať na pamäti, že infekciu HIV charakterizujú aj: anémia, lymfatická a leukopénia, trombocytopénia, zvýšenie hladiny β2-mikroglobulínu a C-reaktívneho proteínu, zvýšenie aktivity transamináz v krvnom sére.
Klinická a laboratórna diagnostika infekcie HIV má tri smery:
- Stanovenie skutočnosti infekcie HIV, diagnostika infekcie HIV.
- Stanovenie štádia klinického priebehu ochorenia a identifikácia sekundárnych ochorení.
- Predikcia progresie klinického priebehu ochorenia, laboratórne sledovanie účinnosti liečby a nežiaducich účinkov antiretrovírusových liekov.
1. Zistenie infekcie HIV, diagnostika infekcie HIV
Na stanovenie infekcie HIV sa používajú tieto špecifické indikátory: protilátky proti HIV, HIV antigény, HIV RNA a provírusová DNA. Protilátky proti HIV sa stanovujú pomocou enzýmovej imunoanalýzy (ELISA) alebo imunoblotingu, čo je v podstate typ ELISA. Antigény (proteíny) HIV sa stanovujú pomocou ELISA. Pomocou molekulárno-genetických metód polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) a bDNA možno určiť HIV RNA a provírusovú DNA. Použitie dodatočnej metódy hybridizácie nukleových kyselín so špecifickými DNA sondami umožňuje kontrolovať špecifickosť DNA sekvencií získaných počas PCR. Citlivosť PCR je detekcia vírusových génov v jednej z päťtisíc buniek.
V prípade primárnej infekcie sa pozoruje nasledujúca dynamika markerov HIV v krvi infikovaných ľudí. V prvom mesiaci dochádza v dôsledku aktivácie replikačného procesu k prudkému zvýšeniu vírusovej záťaže (obsahu HIV RNA v plazme), následne v dôsledku šírenia vírusu a masívnej infekcie cieľových buniek v krvi a lymfatických uzlín, je možné určiť provírusovú DNA. Skutočnosť detekcie provírusovej DNA integrovanej do genómu cieľovej bunky má prvoradú diagnostickú hodnotu.
Vírusová záťaž odráža intenzitu replikačného procesu v infikovaných bunkách. V období primárnej infekcie je úroveň vírusovej záťaže pri infekcii rôznymi subtypmi HIV odlišná, ale dynamika jej zmien je približne rovnaká. Napríklad pri infekcii podtypom B, ak je v prvom mesiaci po infekcii hodnota vírusovej záťaže 700 kópií / ml, potom v 2. mesiaci dôjde k poklesu na 600, v 3. - až 100, v 4. - až 50 kópií / ml. Takáto dynamika sa pozoruje na pozadí zvýšenia obsahu špecifických protilátok proti HIV v krvi. Obsah provírusovej DNA v krvných mononukleárnych bunkách HIV-infikovaných je charakterizovaný relatívnou stálosťou počas prvých 6 mesiacov s miernymi výkyvmi v niektorých podtypoch. Zaťaženie RNA a DNA teda nie je totožné.
Počas inkubačnej fázy nedochádza po určitú dobu k tvorbe špecifických protilátok proti HIV v množstve dostatočnom na stanovenie existujúcimi laboratórnymi metódami. Pred registráciou protilátok sa v krvi na veľmi krátky čas pozoruje výskyt proteínu Nef, ktorý potláča replikačný proces, a štruktúrneho proteínu p24. Antigén p24 je možné zistiť v krvi metódou enzýmovej imunoanalýzy už 1-2 ped po infekcii a stanoviť do 8. týždňa, potom jeho obsah prudko klesá. Ďalej v klinickom priebehu infekcie HIV dochádza k druhému zvýšeniu obsahu proteínu p24 v krvi. Pripadá na vznik AIDS. Vymiznutie voľných (neviazaných protilátkami) jadrových proteínov p24 v krvi a objavenie sa špecifických protilátok proti HIV proteínom znamenajú nástup sérokonverzie (obr. 9.6).
Virémia a antigenémia spôsobujú tvorbu špecifických IgM protilátok (anti-p24, anti-gp41, anti-gp120, anti-gp160). Voľné protilátky tried IgM a IgG proti proteínu p24 sa môžu objavovať od 2. týždňa, ich obsah sa zvyšuje v priebehu 2-4 týždňov, pričom dosiahne určitú úroveň, na ktorej zotrváva mesiace (IgM) a roky (IgG) (obr. 9.7).
Výskyt úplnej sérokonverzie, keď je v periférnej krvi zaznamenaná vysoká hladina špecifických IgG protilátok proti štrukturálnym proteínom HIV p24, gp41, gp120, gp160, výrazne uľahčuje diagnostiku infekcie HIV. Protilátky proti HIV sa objavia u 90-95% infikovaných do 3 mesiacov po infekcii, u 5-9% - v období od 3 do 6 mesiacov od okamihu infekcie a u 0,5-1% - neskôr.
Napriek tomu, že protilátky proti HIV sa objavujú ako posledné, hlavným laboratórnym diagnostickým ukazovateľom je doteraz detekcia špecifických protilátok pomocou ELISA a imunoblottingu.
Údaje uvedené v tabuľke 9.2 [šou] a 9.3 [šou] , jasne demonštrujú vysokú citlivosť moderných enzymaticky viazaných imunosorbčných testovacích systémov pri určovaní protilátok proti HIV, ktorá je lepšia ako citlivosť imunoblottingu. V niektorých prípadoch môže byť primárny pozitívny výsledok testu ELISA potvrdený imunoblotovaním až po 2-3 týždňoch.
| Tabuľka 9.3. Príklad monitorovania sérokonverzie (podľa N. Fleuryho, 2000) | |||||
| Moment odhodlania | Antigén P24, pg/ml | Protilátky proti HIV proteínom | |||
| ELISA, OP arr / OP c ** | Imunoblotting | ||||
| Hiv DUO | Gen-screen | Uniforma | |||
| Pacient 1 | |||||
| Predovšetkým | 17 | 1,24 | menej ako 1 | menej ako 1 | * |
| Po 4 dňoch | 67 | 1,36 | 1,85 | menej ako 1 | - |
| Za 7 dní | * | 2,33 | 6,84 | menej ako 1 | - |
| Po 2 dňoch | * | 6,77 | 15,0 | 4,8 | gp160 |
| Pacient 2 | |||||
| Predovšetkým | 400 | 13 | menej ako 1 | menej ako 1 | - |
| Za 5 dní | 450 | 18 | 2,11 | menej ako 1 | - |
| Po 10 dňoch | * | 33 | 12,19 | 2,9 | gp160 |
| Poznámka: * - stanovenie nebolo vykonané ** - pomer optickej hustoty študovanej vzorky séra ku kritickej (prahovej) hodnote optickej hustoty |
|||||
Pri vyšetrovaní HIV-infikovaných pacientov (HIV-infikovaných) pomocou imunoblotovacích testovacích systémov od popredných svetových spoločností sa protilátky proti gp160 a p24 / 25 zistia vo všetkých prípadoch, protilátky proti iným proteínom sa zistia v 38,8-93,3 % prípadov (tab. 2) 9.4 [šou] ).
Ťažkosti pri detekcii protilátok u pacientov s infekciou HIV môžu nastať v obdobiach masívnej virémie a antigenémie, keď sú existujúce špecifické protilátky v krvi spojené s vírusovými časticami a replikačný proces predstihuje produkciu nových antivírusových protilátok. Táto situácia môže vzniknúť a zmiznúť počas infekčného procesu.
U pacientov s pôvodne oslabeným imunitným systémom sa virémia a antigenémia objavujú skôr a zostávajú na vysokej úrovni až do výsledku ochorenia. U takýchto pacientov je nízky obsah voľných protilátok proti HIV, a to z dvoch dôvodov - nedostatočná tvorba protilátok B-lymfocytmi a väzba protilátok viriónmi a rozpustnými HIV proteínmi, preto na stanovenie infekcie testovacie systémy so zvýšenou citlivosťou alebo sú potrebné modifikácie analytických metód, ktoré poskytujú štádium uvoľňovania protilátky z imunitných komplexov.
Najčastejšie k poklesu obsahu protilátok proti HIV z uvedených príčin dochádza v terminálnom štádiu, kedy protilátky proti HIV v sére nemusia byť zachytené ani enzýmovo viazanou imunoanalýzou, ani metódou Western blot. Okrem objavenia sa špecifických protilátok proti HIV je imunitná odpoveď v prvých 4 mesiacoch charakterizovaná znížením obsahu infikovaných CD4+ buniek v krvi a zvýšením CD8+ buniek. Ďalej sa obsah buniek nesúcich receptory CD4 a CD8 stabilizuje a zostáva nejaký čas nezmenený. Zvýšenie obsahu CD8-lymfocytov je ochranná reakcia, pretože bunkovo závislá cytotoxicita je realizovaná CD8+ lymfocytmi, ktoré sú zamerané na ničenie buniek infikovaných HPV. Na začiatku reagujú cytotoxické lymfocyty (CTL) na regulačný proteín Nef vírusu, ktorý hrá dôležitú úlohu pri znižovaní vírusovej (RNA) záťaže v plazme HIV-infikovanej osoby v prvých mesiacoch. Potom sa vytvorí odpoveď z CTL ostatným, vr. štrukturálne, HIV proteíny, v dôsledku čoho sa 12 mesiacov po infekcii výrazne zvyšuje cytotoxický účinok.
Schémy na laboratórnu diagnostiku infekcie HIV
S prihliadnutím na uvedenú dynamiku špecifických markerov HIV infekcie v praxi je vhodné u dospelých dodržiavať nasledovné laboratórne diagnostické schémy (obr. 9.8-9.10).
Diagramy odrážajú tri hlavné štádiá primárnej laboratórnej diagnostiky infekcie HIV:
- Skríning.
- Odkaz.
- Expert.
Potreba niekoľkých stupňov laboratórnej diagnostiky je primárne spôsobená ekonomickými úvahami. Napríklad náklady na vykonanie jednej odbornej štúdie pomocou domácich testovacích systémov pomocou metódy imunoblotovania sú až 40 USD, skríning (pomocou metódy ELISA) - asi 0,2, to znamená, že pomer je 1: 200 .
V prvej fáze (obr. 9.8) sa testované osoby testujú na protilátky proti HIV pomocou jedného enzýmového imunoanalýzy určeného na detekciu protilátok proti obom typom vírusu - HIV-1 a HIV-2.
Výrobcovia v navrhovaných testovacích systémoch používajú ako antigénny základ vírusový lyzát, rekombinantné proteíny, syntetické peptidy. Každý z uvedených nosičov antigénnych determinantov HIV má svoje výhody a nevýhody. Preto pri výbere testovacích systémov s približne rovnakými nákladmi by sa mali uprednostniť súpravy s najvyššou citlivosťou (najlepšie 100 %). Spomedzi testovacích systémov rovnakej ceny a citlivosti je vhodné zamerať sa na tie s maximálnou špecifickosťou.
Na základe vírusového lyzátu boli vytvorené prvé testovacie systémy na laboratórnu diagnostiku HIV infekcie. V 80. rokoch minulého storočia sa takéto testovacie systémy vyznačovali senzitivitou menšou ako 100 % a nízkou špecificitou, prejavujúcou sa veľkým počtom (až 60 %) falošne pozitívnych výsledkov.
Počas tvorby viriónu v kultúre lymfocytov je jeho membrána vytvorená z vonkajšej membrány a preto obsahuje antigény hlavného histokompatibilného komplexu triedy I a II. Táto okolnosť spôsobuje falošne pozitívne reakcie, ak sú v krvi pacientov prítomné protilátky proti aloantigénom histokompatibility.
Neskôr sa na získanie vírusu navrhlo použiť kultúru makrofágov, v ktorej sa vírusové častice tvoria hlavne intracelulárne pučaním nie z vonkajšej membrány bunky, ale z membrán endoplazmatického retikula. Táto technológia znížila počet falošných poplachov.
Jedny z najlepších z hľadiska najdôležitejších charakteristík – senzitivity a špecificity – sú uznávané enzýmovo viazané imunosorbentové analytické systémy, ktoré využívajú kombináciu purifikovaného vírusového lyzátu so syntetickými peptidmi, ktoré sú antigénne najvýznamnejšími časťami vírusových proteínov, resp. rekombinantné proteíny.
Citlivosť testovacieho systému závisí aj od vlastností ostatných komponentov súprav. Testovacie systémy, v ktorých sa používajú konjugáty, ktoré rozpoznávajú protilátky nielen triedy IgG, ale aj IgM a IgA, umožňujú odhaliť skoršiu fázu sérokonverzie. Sľubne sa javí využitie testovacích systémov, pomocou ktorých je možné súčasne stanoviť tak antivírusové protilátky, ako aj antigén p24, čím je laboratórna diagnostika HIV infekcie ešte skoršia.
Primárny pozitívny výsledok sa musí znova skontrolovať opätovným vyšetrením vzorky v tom istom testovacom systéme, ale pokiaľ možno v inej dávke a iným laboratórnym asistentom. Ak sa počas druhej štúdie získa negatívny výsledok, štúdia sa uskutoční tretíkrát.
Po potvrdení pozitívneho výsledku je vhodné opätovne odobrať krv a otestovať ju na protilátky proti HIV ako primárne. Opakovaný odber krvi zabraňuje chybám spôsobeným nepresným označením skúmaviek a vypĺňaním odporúčacích formulárov.
Sérum, ktoré je sérum pozitívne v štádiu skríningu, sa posiela do referenčných štúdií vykonaných pomocou dvoch alebo troch vysoko špecifických testovacích systémov ELISA. V prípade dvoch pozitívnych výsledkov sa vykonáva odborná štúdia metódou imunoblotovania.
Použitie enzýmových imunoanalýz v referenčnej diagnostike, pomocou ktorých je možné odlíšiť špecifické protilátky proti HIV-1 a HIV-2, uľahčuje ďalšiu prácu a umožňuje okamžite študovať pozitívnu vzorku v štádiu expertízy pomocou vhodného imunoblottingu (HIV-1 alebo HIV-2)...
Laboratórny odborný posudok o infekcii HIV sa robí až na základe pozitívneho výsledku Western blot. Pri vykonávaní expertnej diagnostiky je potrebné použiť nomenklatúru HIV génov a génových produktov, ktorú v roku 1990 navrhla skupina odborníkov WHO (tabuľka 9.5 [šou] ).
Špecifickosť prúžkov na imunoblote by sa mala posúdiť veľmi opatrne a starostlivo s použitím výsledkov štúdií kontrolných sér (pozitívnych a negatívnych), ktoré sa vykonávajú súbežne so štúdiom experimentálnych vzoriek, a vzorky imunoblotu s označenie HIV proteínov (priložené výrobcom k testovaciemu systému). Interpretácia získaných výsledkov by sa mala vykonať v súlade s pokynmi pripojenými k testovaciemu systému. Kritériom pozitivity je spravidla povinná prítomnosť protilátok proti dvom proteínom (prekurzorovým, vonkajším alebo transmembránovým) kódovaným génom env a možná prítomnosť protilátok proti produktom dvoch ďalších štruktúrnych génov HIV - gag a pol ( Tabuľka 9.6 [šou] ).
| Tabuľka 9.6. Kritériá pre interpretáciu výsledkov imunoblottingu pre HIV-1 a HIV-2 (WHO, 1990) | |||
| Výsledok | HIV-1 | HIV-2 | |
| Pozitívny | +/- pol pruhy +/- pruhy gag | 2 pásma env (prekurzor, vonkajší gp alebo transmembránový gp) +/- pol pruhy +/- pruhy gag |
|
| Negatívne | Nedostatok pásov špecifických pre HIV-1 | Nedostatok pásov špecifických pre HIV-2 | |
| Neistý | Ostatné profily sa nepovažujú za pozitívne alebo negatívne | ||
V prípade získania pochybného výsledku je potrebné použiť zoznam odporúčaní na konečné objasnenie výsledkov imunoblottingu (tabuľka 9.7 [šou] ).
| Tabuľka 9.7. Odporúčania na definitívne objasnenie neistých výsledkov imunoblotu (WHO, 1990) | |
| Prítomnosť pásov zodpovedajúcich HIV proteínom | Interpretácia výsledku, ďalšie úkony |
| HIV-1 | |
| Len p17 | |
| Len P24 a gp160 | Tento neobvyklý vzor sa môže vyskytnúť na začiatku sérokonverzie. Okamžite znova otestujte vzorku. Ak sa získa rovnaký profil, je potrebné odobrať druhú vzorku na testovanie v imunoblote 2 týždne po odbere 1. vzorky. |
| Iné profily | Tieto profily (gag a/alebo pol bez env) môžu naznačovať sérokonverziu alebo nešpecifické reakcie. |
| HIV-2 | |
| Len p16 | Môže byť klasifikovaný ako negatívny, nie sú potrebné žiadne ďalšie definície |
| I lane env s alebo bez gag / pol | Znova otestujte rovnakú vzorku s použitím inej šarže činidiel. |
| Len P24 alebo gp140 | Tento neobvyklý profil sa môže vyskytnúť na začiatku sérokonverzie. Okamžite znova otestujte vzorku. Ak sa získa rovnaký profil, 2 týždne po odobratí prvej vzorky sa musí odobrať druhá vzorka na testovanie imunoblotovaním |
| Iné profily | Tieto profily (gag a/alebo pol bez env) môžu naznačovať sérokonverziu alebo nešpecifické reakcie. |
Podľa odporúčaní Ruského vedeckého a metodického centra pre prevenciu a kontrolu AIDS sa za pozitívny výsledok považuje, ak existujú protilátky proti aspoň jednému z proteínov gp41, gp120, gp160 v kombinácii s protilátkami proti iným špecifickým HIV alebo bez nich. -1 bielkoviny. Tieto odporúčania vychádzajú zo skúseností so sérami detí z nozokomiálnych ložísk, v ktorých sa často stanovovali protilátky len proti jednému z vírusových obalových proteínov.
Väčšina pacientov, ktorí boli pôvodne séropozitívne vyšetrení v ELISA, patrí do fázy perzistujúcej generalizovanej lymfadenopatie (PGL) alebo do asymptomatickej fázy. Preto sa na imunoblote (nitrocelulózový prúžok, na ktorom sú imobilizované HIV proteíny) spravidla stanovuje nasledujúca kombinácia protilátok proti HIV-1: protilátky proti env obalovým proteínom gp160, gp120 a gp41, kódované env. génu v kombinácii s protilátkami proti jadrovým proteínom p24 (proteínový nukleokapsid kódovaný génom gag) a p31/34 (endonukleáza kódovaná génom pol).
Pozitívne reakcie len s gag a/alebo po proteínmi sa môžu vyskytnúť v skorej fáze sérokonverzie a tiež naznačujú infekciu HIV-2 alebo nešpecifickú reakciu.
V prípade získania pochybného výsledku je možné použiť rôzne metodické techniky na objasnenie skutočnosti infekcie HIV.
V závislosti od technických možností (dostupnosť diagnostických súprav a činidiel, vybavenie so špeciálnym vybavením a školenie personálu) odborné laboratórium vykonáva dodatočné diagnostické štúdie (obrázok 9.10).
V niektorých prípadoch je vhodné použiť molekulárne genetické metódy na stanovenie genetickej sekvencie HIV v sére, krvných lymfocytoch alebo punkciách lymfatických uzlín. Overenie špecifickosti DNA sekvencií získaných ako výsledok PCR sa môže uskutočniť metódou hybridizácie nukleových kyselín so špecifickými DNA sondami.
Metódy rádioimunoprecipitácie (RIP) a nepriamej imunofluorescencie (IFL) možno použiť aj na finálnu verifikáciu sér s pochybnými výsledkami pri imunoblottingu.
Detekcia HIV RNA v krvnej plazme kvalitatívnou alebo kvantitatívnou metódou nie je pre diagnózu HIV infekcie významná. Tento výsledok by mal byť potvrdený štandardnými metódami, ako je imunobloting, 2-4 mesiace po prijatí primárnej spornej alebo negatívnej odpovede.
Izolácia HIV v bunkovej kultúre je konečná pravda. Metóda je však komplikovaná, drahá a vykonáva sa len v špeciálne vybavených výskumných laboratóriách.
Obsah CD4 + - buniek v krvi je nešpecifický ukazovateľ, ale v sporných prípadoch (ELISA "+", imunoblot "-", prítomnosť klinických príznakov HIV infekcie / AIDS) môže slúžiť ako vodítko pre urobiť odborné rozhodnutie. Ak má laboratórium schopnosť vykonávať iba imunobloting, mali by ste dodržiavať odporúčania uvedené v tabuľke. 9.7 a Obr. 9.9.
Osoby, ktorých sérové odborné vyšetrenie prinieslo pochybné (neurčité) výsledky, s výnimkou prípadov detekcie protilátok len proti p17 (HIV-1) alebo p16 (HIV-2), by mali byť opätovne testované do 6 mesiacov (po 3 mesiacoch). V prípade skutočnej infekcie HIV je po 3-6 mesiacoch pozorovaný "pozitívny" trend v spektre protilátok - dodatočná tvorba protilátok proti iným proteínom vírusu. Falošná reakcia je charakterizovaná pretrvávaním pochybného vzoru imunitného blotovania po dlhú dobu alebo zmiznutím podozrivých pásov. Ak sú po stanovenom období výsledky opakovaného imunoblotingu negatívne alebo ostanú pochybné, potom pri absencii rizikových faktorov, klinických symptómov alebo iných faktorov spojených s infekciou HIV možno osobu považovať za séronegatívnu na protilátky proti HIV-1 a HIV. -2.
Falošne pozitívne výsledky v dôsledku obsahu protilátok proti aloantigénom histokompatibility v krvi pacientov, ktoré sú súčasťou obalu HIV, sa na imunoblote objavujú vo forme pásov na úrovni gp41 a gp31. Dôvody iných nešpecifických reakcií (napríklad na p24, ktorý sa často vyskytuje u jedincov s autoimunitnými procesmi) zatiaľ nie sú objasnené.
Zlepšenie technológie výroby enzýmovo viazaných imunosorbčných testovacích systémov umožnilo dosiahnuť vysokú citlivosť - až 99,99%, pričom citlivosť metódy imunoblotovania je 97%. Preto negatívny výsledok imunoblotingu s pozitívnymi výsledkami v ELISA môže naznačovať počiatočné obdobie sérokonverzie, charakterizované nízkou hladinou špecifických protilátok. Štúdiu je preto potrebné zopakovať po 1,5 – 2 mesiacoch, čo je čas potrebný na dokončenie sérokonverzie, na dosiahnutie koncentrácie špecifických protilátok v krvi dostatočnej na detekciu imunoblottingom.
Pozitívny výsledok (výsledky) štúdie v referenčnom alebo jedinom skríningovom štádiu laboratórnej diagnostiky infekcie HIV, t. j. pozitívny výsledok v akomkoľvek enzýmovom imunosorbentovom teste, v konečnom dôsledku nepotvrdený odbornými metódami, sa interpretuje ako prítomnosť skrížene reagujúce protilátky v krvi vyšetrovaných protilátok. Krížová reakcia sa týka väzby nešpecifických miest protilátkami na HIV proteíny alebo peptidy používané ako antigénny základ v testovacom systéme, v ktorom sa získa pozitívny výsledok.
Pri absencii imunodeficiencie a klinických príznakov infekcie HIV sa takéto osoby považujú za séronegatívne na protilátky proti HIV a mali by byť vyradené z registra.
Konečná diagnóza HIV infekcie je stanovená až na základe všetkých klinických, epidemiologických a laboratórnych údajov. O diagnóze HIV infekcie má právo informovať pacienta iba ošetrujúci lekár.
Hlavnou metódou potvrdzujúcej (odbornej) laboratórnej diagnostiky HIV infekcie je imunoblot. Vzhľadom na jeho nižšiu citlivosť v porovnaní s testom ELISA však množstvo výskumníkov navrhlo použiť kombináciu niekoľkých testovacích systémov na konečné stanovenie prítomnosti špecifických protilátok proti HIV. Napríklad G. van der Groen a kol. navrhli alternatívu k metóde imunoblotovania na kontrolu pozitívnych výsledkov skríningového štádia laboratórnej diagnostiky HIV infekcie. Ide o štúdium materiálu paralelne v troch testovacích systémoch, ktoré sú založené na rôznych metódach zisťovania špecifických protilátok proti HIV (niekoľko variantov ELISA, aglutinačný test) pomocou antigénov rôzneho charakteru. Autorom sa podarilo nájsť také kombinácie testovacích systémov, ktorých použitie poskytuje 100% senzitivitu a špecifickosť v porovnaní s výsledkami získanými pri imunoblotingu.
Lacnosť tejto metódy expertnej diagnostiky je nepochybnou výhodou, avšak nedostatok informácií o tom, ktoré špecifické proteíny vírusu majú protilátky v krvi pacienta, neumožňuje posúdiť špecifickosť reakcie v každom jednotlivom prípade, ako aj sledovať zmeny v spektre protilátok v ranom štádiu sérokonverzie.
Laboratórna diagnostika infekcie HIV u detí narodených matkám infikovaným HIV má svoje vlastné charakteristiky. Od okamihu narodenia môžu materské protilátky proti HIV cirkulovať v krvi takýchto detí dlhú dobu (až 15 mesiacov). Placentárnou bariérou prenikajú iba imunoglobulíny triedy IgG, preto detekcia HPV špecifických nmmupoglobulínov tried IgM a IgA u dieťaťa umožňuje potvrdiť infekciu, ale negatívny výsledok nemôže naznačovať neprítomnosť HIV.
Deti do 1 mesiaca ešte nemajú replikáciu HPV a jedinou overovacou metódou je PCR. Stanovenie antigénu p24 u detí starších ako 1 mesiac je tiež potvrdzujúcou metódou.
Neprítomnosť protilátok proti HIV u novorodencov neznamená, že vírus neprenikol cez placentárnu bariéru. V každom prípade sú deti matiek infikovaných vírusom HIV podrobené laboratórnemu diagnostickému vyšetreniu a pozorovaniu do 36 mesiacov od narodenia.
Výsledky laboratórnych testov na markery HIV infekcie si vyžadujú starostlivú interpretáciu a mali by sa posudzovať len v spojení s údajmi z epidemiologických a klinických prieskumov. Na druhej strane je potrebné poznamenať, že napriek vysokej citlivosti moderných metód negatívne výsledky výskumu nemôžu úplne vylúčiť prítomnosť infekcie HIV. Preto negatívny výsledok testu, napríklad imunoblotovaním, možno formulovať len ako neprítomnosť špecifických protilátok proti HIV-1 a HIV-2.
Diagnóza infekcie HIV u séronegatívnych pacientov
Kvalita testovacích systémov používaných v laboratórnej diagnostike HIV infekcie sa každým rokom zlepšuje, zvyšuje sa ich citlivosť. Vysoká variabilita HIV však môže viesť k vzniku nových typov, protilátky proti ktorým nemusia byť existujúce testovacie systémy rozpoznané. Okrem toho existujú prípady atypickej humorálnej odpovede imunitného systému hostiteľa na vírus. Takže L. Montagnier v roku 1996 informoval o dvoch pacientoch s AIDS, u ktorých sa v krvi posledných niekoľko rokov nezistili špecifické protilátky, diagnóza bola stanovená na základe klinických údajov a laboratórne potvrdená iba izoláciou HPV-1 v bunkovej kultúre. V takýchto prípadoch je potrebné použiť odporúčania WHO, podľa ktorých je klinická diagnóza HIV infekcie u dospelých a detí možná v prítomnosti jedného z 12 indikátorov AIDS:
- kandidóza pažeráka, priedušnice, priedušiek, pľúc;
- extrapulmonálna kryptokokóza;
- kryptosporidióza s hnačkou dlhšie ako jeden mesiac;
- cytomegalovírusová lézia akéhokoľvek orgánu (okrem a okrem pečene, sleziny a lymfatických uzlín u pacienta staršieho ako 1 mesiac):
- infekcia spôsobená vírusom herpes simplex pretrvávajúca dlhšie ako 1 mesiac u pacienta staršieho ako 1 mesiac;
- lymfóm mozgu u pacienta mladšieho ako 60 rokov;
- lymfocytárna intersticiálna pneumónia u dieťaťa mladšieho ako 13 rokov;
- disiminovaná infekcia spôsobená baktériami skupiny Micobacterium avium intracellulare alebo M. Kansassii;
- pneumocystovej pneumónie;
- progresívna multifokálna leukoencefalopatia;
- toxoplazmóza centrálneho nervového systému u pacientov starších ako 1 mesiac.
Prítomnosť jednej z týchto chorôb umožňuje diagnostikovať infekciu HIV v neprítomnosti možnosti vykonania laboratórneho krvného testu na prítomnosť protilátok proti HIV alebo dokonca aj pri získaní séronegatívneho výsledku.
Zdroj: Lekárska laboratórna diagnostika, programy a algoritmy. Ed. Prednášal prof. Karpishchenko A.I., Petrohrad, Intermedica, 2001
Diagnóza infekcie HIV zahŕňa dve fázy: zistenie skutočnej skutočnosti infekcie HIV a určenie štádia ochorenia. Po určení štádia neodmysliteľne nasleduje objasnenie podstaty priebehu ochorenia a následne tvorba prognózy u daného pacienta, ako aj voľba taktiky liečby.
Ako viete, diagnostika akejkoľvek infekčnej choroby je založená na porovnaní epidemiologických, klinických a laboratórnych údajov a zveličovanie hodnoty jednej zo skupín týchto údajov môže viesť k diagnostickým chybám.
Epidemiologické kritériá pre infekciu HIV .
Prvým krokom pri diagnostike infekcie HIV je zber epidemiologickej anamnézy a iných epidemiologických údajov o vyšetrovanom pacientovi. Nedostatok epidemiologických údajov môže výrazne skomplikovať diagnostiku HIV infekcie a brániť realizácii protiepidemických opatrení.
Epidemiologické kritériá môžu byť niekedy rozhodujúce pri stanovení diagnózy infekcie HIV, ale môžu mať aj druhoradý význam. Kritériom vysokej pravdepodobnosti nákazy je zistenie u vyšetrovanej osoby takých rizikových faktorov nákazy, ako je transfúzia darcovskej krvi prijatej od HIV infikovanej osoby, narodenie HIV infikovaného dieťaťa vyšetrovanej žene. Pravdepodobnosť nákazy je vysoká v prípade narodenia vyšetrovanej osoby od HIV-infikovanej matky, sexuálneho kontaktu s HIV-infikovanou osobou, spoločného parenterálneho užívania drog s HIV-infikovanou osobou. Určité riziko infekcie sa zistí pri spoľahlivých parenterálnych intervenciách, ktoré sa vykonávajú nástrojmi, ktoré môžu byť kontaminované HIV (to znamená v nozokomiálnych a podobných ohniskách infekcie HIV s parenterálnym prenosom HIV).
O značnom riziku infekcie možno diskutovať v prípadoch, keď subjekt hlási sexuálny styk alebo parenterálne užívanie drog v oblastiach, kde je HIV významne bežný v skupine populácie, do ktorej subjekt patrí.
Sexuálny styk a užívanie drog v oblastiach s nízkou prevalenciou HIV infekcie zároveň nevylučuje možnosť infekcie HIV.
Absencia spoľahlivých rizikových faktorov pre infekciu HIV môže spochybniť laboratórne údaje. V takýchto prípadoch sa odporúča zopakovať laboratórne testy.
Klinické kritériá pre infekciu HIV.
Včasná diagnostika HIV infekcie zabezpečuje včasnú liečbu pacienta a nasadenie preventívnych opatrení v ohnisku nákazy, zamedzujúcich neúmyselnému prenosu vírusu z infikovanej osoby na zdravého človeka. Včasná diagnostika napokon umožňuje včasné lekárske vyšetrenie, psychologickú pomoc a sociálnu rehabilitáciu. Prvé úspechy v liečbe pacientov umožňujú pri včasnej diagnóze výrazne predĺžiť život pacientov a dokonca aj nádej na vyliečenie.
Zložitosť včasnej diagnostiky na základe klinického obrazu spočíva v nešpecifickosti, polymorfizme symptómov v štádiu II, nehovoriac o absencii kliniky v štádiu I. Napriek tomu vo všetkých prípadoch nemotivovanej únavy, prítomnosti nočného potenia, bolesti hlavy najmä na pozadí krátkodobej horúčky (3-10 dní) s teplotou 38-38,50 C, sprevádzanej tonzilitídou, dlhotrvajúcim hnačkovým syndrómom, úbytkom hmotnosti v krátkom čase je potrebné v prvom rade vylúčiť infekciu HIV . Diagnózu v tomto období napomáha identifikácia rôznych kožných vyrážok (škvrny, papuly, roseola, abscesy) alebo furunkulózy pri objektívnom vyšetrení. Prítomnosť lymfadenopatie, dokonca aj v prípadoch zväčšenia jednej skupiny lymfatických uzlín, a ešte viac pri generalizovanej, je pravdepodobnejšie klinicky podozrenie na infekciu HIV. Ochorenie je charakterizované najmä zväčšením zadných krčných, submandibulárnych, supra- a podkľúčových, axilárnych a ulnárnych lymfatických uzlín. Spravidla sa zväčšujú až do priemeru 2-5 cm, sú nebolestivé, husto elastickej konzistencie a občas sa spájajú do konglomerátu. Pre infekciu HIV je celkom typické zväčšenie viac ako jednej uzliny, viac ako jednej skupiny (s výnimkou inguinálnej), trvajúce viac ako 3 mesiace.
V počiatočnej fáze ochorenia sa často vyskytujú psycho-neurologické symptómy: úzkosť, depresia, neistota chôdze, znížená zraková ostrosť, záchvaty s príznakmi poškodenia psycho-emocionálnej sféry (porucha pamäti, zábudlivosť, neprimerané správanie), otupenie emócií). K najcharakteristickejším vlastnostiam počiatočné štádiá infekcie HIV zahŕňajú:
1. Zníženie telesnej hmotnosti o menej ako 10%;
2. Zmeny na koži a slizniciach (seboroická dermatitída, folikulitída, prurigo, psoriáza, plesňové infekcie nechtov, recidivujúce vredy v ústach, nekrotizujúca gingivitída);
3 ... Herpes zoster u ľudí mladších ako 50 rokov;
4. Opakujúce sa infekcie horných dýchacích ciest;
V medzistupeň najcharakteristickejšia je choroba charakterizovaná klinikou rozsiahlej superinfekcie, ktorá sa tvorí v dôsledku imunodeficiencie:
1 ... Progresívne zníženie telesnej hmotnosti nad 10%;
2 ... Hnačka neznámeho pôvodu, trvajúca viac ako 1 mesiac ..;
3 ... orálna kandidóza;
4 ... leukoplakia;
5. pľúcna tuberkulóza;
6. periférna neuropatia;
7. Lokalizované formy Kaposiho sarkómu;
8. šíriaci sa pásový opar;
9. Závažná, opakujúca sa bakteriálna infekcia (pneumónia, sinusitída, pyomyozitída).
Pre neskoré štádium, ktoré umožňujú diagnostikovať infekciu HIV alebo v každom prípade vykonať diferenciálnu diagnostiku, zahŕňajú:
1. Pneumocystis pneumónia;
2 ... toxoplazmóza;
3. kryptokokóza;
4. CMV infekcia;
5. Herpes simplex;
6. Progresívna multifokálna leukoencefalopatia;
7. histoplazmóza;
8. Kandidová ezofagitída;
9. infekcia MAC;
10. Salmonella septikémia;
11. Extrapulmonálna tuberkulóza;
12. Lymfóm, Kaposiho sarkóm;
13. kachexia;
14. HIV encefalopatia.
V roku 1988 WHO navrhla na účely klinickej diagnózy vykonať skóre symptómov dostupné pre pacienta s podozrením na infekciu HIV:
Pretrvávajúca generalizovaná lymfadenopatia 0
Zmeny na koži a slizniciach 1
Chudnutie 1
Silná únava 1
Herpes simplex 2
Hnačka trvajúca viac ako 1 mesiac. 4
Horúčka trvajúca viac ako 1 mesiac 4
Strata hmotnosti o viac ako 10% 4
Pľúcna tuberkulóza 5
Opakovaná bakteriálna infekcia 5
Orálna leukoplakia 5
Stomatitída, drozd v ústach 5
Lokalizovaný Kaposiho sarkóm 8
Kachexia 12
Zároveň sa hodnotí súčet bodov od 0 do 3, pretože pravdepodobnosť infekcie HIV je veľmi nízka, 4-11 bodov - ochorenie je pravdepodobné a 12 a viac - veľmi pravdepodobné.
Vo všeobecnosti je klinická diagnóza infekcie HIV predovšetkým diagnostikou spektra patológií spojených s AIDS u pacienta so sekundárnou imunodeficienciou. Keďže HIV-indikátorové ochorenia zahŕňajú 23 nozologických foriem, najvhodnejší je syndrómový prístup k diagnostike. Takmer vždy má pacient syndróm všeobecnej intoxikácie (nemotivovaná slabosť, letargia, rýchla únava), ktorý sa vyvíja na pozadí dlhotrvajúceho subfebrilného stavu alebo horúčky neznámeho pôvodu, častejšie v noci a ráno, sprevádzaný hojným potom. Syndróm nemotivovanej generalizovanej periférnej lymfadenopatie je konštantný, v 20 % sprevádza hepatosplenomegália rôznej závažnosti. Jedným z popredných syndrómov ochorenia je syndróm bronchopulmonálnej patológie, hoci hlboké lézie pľúcneho tkaniva vo forme pneumocystovej pneumónie sa vyvíjajú v pokročilých prípadoch ochorenia, pretože pneumocystóza sa vyvíja na pozadí hlbokej imunodeficiencie. Ale viac ako 1 mesiac sa syndróm nemotivovanej hnačky týka skorého objavenia sa, je charakterizovaný rezistenciou na liekovú terapiu. Jedným zo syndrómov infekcie HIV je vlnovitá artralgia nejasnej etiológie. Medzi najcharakteristickejšie prejavy ochorenia patrí syndróm lézií kože a slizníc, prejavujúci sa nešpecifickým makulopapulárnym exantémom, odolným voči steroidnej terapii, ekzémom, stafylokokovým impetigom. K dermatologickým prejavom patria aj recidivujúce mykózy (mykózy, kandidózy, bakteriálne (folikulitída, furunkulóza, hydroadenitída), vírusové (herpetické) lézie kože a slizníc, napokon infekciu HIV charakterizujú aj novotvary, najmä vo forme Kaposiho sarkómu a lymfóm a tiež niektoré iné typy nádorov.
Prítomnosť aspoň dvoch klinických a dvoch klinických a laboratórnych (leukolyphoneutropénia, hypogamaglobulinémia) medzi vyššie uvedenými príznakmi u pacienta umožňuje diagnostikovať infekciu HIV s vysokou mierou spoľahlivosti. Ale zároveň, ak dva zo syndrómov, ktoré sú u pacientov veľmi časté, ako je horúčka a lymfadenopatia, pretrvávajúce mesiac alebo dlhšie, pretrvávajúca nemotivovaná hnačka, pokles telesnej hmotnosti o viac ako 10 % alebo silné nočné potenie spôsobujú viesť k diagnóze a dôkladnému laboratórnemu vyšetreniu.
V etapa 2a na ochorenie možno predpokladať len príznak perzistujúcej generalizovanej lymfadenopatie u rizikového pacienta alebo v prítomnosti epidemiologickej anamnézy.
V etapa 2b(skoro alebo slabo vyjadrené) somatická pohoda, normálna aktivita je stále zachovaná. Lézie kože a slizníc nie sú závažné, opakované infekcie dýchacích ciest nie sú generalizované, strata telesnej hmotnosti nepresahuje 10 %.
Podľa odporúčaní WHO je spoľahlivá klinická diagnostika infekcie HIV u dospelých a detí možná v prítomnosti jedného z 12 indikátorov AIDS: 1) kandidóza pažeráka, priedušnice, priedušiek, pľúc; 2) mimopľúcna kryptokokóza; 3) kryptosporidióza s hnačkou trvajúcou viac ako jeden mesiac; 4) cytomegalovírusová lézia akéhokoľvek orgánu (okrem a okrem pečene, sleziny a lymfatických uzlín u pacienta staršieho ako 1 mesiac); 5) infekcia spôsobená vírusom herpes simplex pretrvávajúca dlhšie ako 1 mesiac u pacienta staršieho ako 1 mesiac; 6) Kaposiho sarkóm u pacienta mladšieho ako 60 rokov; 7) cerebrálny lymfóm u pacienta mladšieho ako 60 rokov; 8) lymfocytárna intersticiálna pneumónia u dieťaťa mladšieho ako 13 rokov, 9) diseminovaná infekcia spôsobená baktériami skupiny Micobacterium avium intracellulare alebo M. Kansassii; 10) pneumocystovej pneumónie; 11) progresívna multifokálna leukoencefalopatia; 12) toxoplazmóza centrálneho nervového systému u pacientov starších ako 1 mesiac. Prítomnosť jednej z týchto chorôb umožňuje diagnostikovať infekciu HIV v neprítomnosti sérologického enzýmového imunosorbentného testu alebo dokonca aj vtedy, ak sa získa séronegatívny výsledok.
Nemenej náročná je aj diferenciácia fáz ochorenia, t.j. diferenciácia štádií podľa klinických kritérií. Podľa odborníkov z CDC (USA) je najobjektívnejším kritériom počet T-pomocníkov, a nie klinické prejavy, pretože mnohé z týchto stavov sa často vyskytujú u ľudí, ktorí nie sú infikovaní HIV. V roku 1991 centrum určilo, že diagnóza AIDS môže byť stanovená, ak: a) infikovaná osoba má jeden z 23 stavov spojených s AIDS alebo b) je infikovaná HIV a má menej ako 200 CD4+ buniek/mm.
Laboratórne kritériá pre infekciu HIV.
Testovanie na infekciu HIV primárne podlieha:
2 ... Osoby s klinikou kandidóza ezofagitída, kandidóza priedušiek a pľúc, diseminovaná alebo mimopľúcna kokcidioidomykóza, pneumocystová pneumónia, mimopľúcna kryptokokóza, kryptosporidióza s hnačkou trvajúcou viac ako 1 mesiac, cytomegalovírusové lézie vnútorných orgánov iných ako pečeň, slezina 6 lymfatických uzlín.retinitída so stratou zraku, herpetická infekcia s multifokálnymi vredmi trvajúcimi viac ako 1 mesiac, bronchitída, pneumónia alebo ezofagitída, recidivujúci pásový opar, desiminovaná alebo extrapulmonálna histoplazmóza, pľúcna alebo mimopľúcna tuberkulóza, izosporiáza s viac ako 1 alebo mimopľúcna hnačka. infekcie, progresívna multifokálna leukoencefalopatia, toxoplazmóza mozgu, salmonelová septikémia, Kaposiho sarkóm, lymfóm, lymfoidná intersticiálna pneumónia (u detí)
V súčasnosti sa na laboratórnu diagnostiku HIV infekcie využívajú rôzne metódy detekcie HIV, HIV antigénov a génového materiálu, ako aj metódy detekcie protilátok proti HIV. Všetky tieto metódy majú rôznu účinnosť, vyžadujú rôzne vybavenie a rôzne úrovne školenia personálu. Výsledky týchto štúdií si vyžadujú kompetentnú interpretáciu.
... diagnostika akéhokoľvek infekčného ochorenia je založená na porovnaní epidemiologických, klinických a laboratórnych údajov a zveličovanie hodnoty niektorej zo skupín týchto údajov môže viesť k diagnostickým omylom.
Diagnóza infekcie HIV zahŕňa dve fázy:
jaštádium - stanovenie skutočnej skutočnosti infekcie HIV
;
IIštádium - určenie štádia ochorenia
.
STANOVENIE SKUTOČNOSTI HIV INFEKCIE
Zistenie skutočného faktu o infekcii HIV (t. j. identifikácia infikovaných HIV) tiež zahŕňa dve fázy:
Etapa I- spojený imunosorbentový test(AK): metóda ELISA je skríningová (skríningová) metóda - výber pravdepodobne infikovaných osôb, to znamená, že jej účelom je identifikovať podozrivé osoby a vyradiť zdravé osoby; protilátky proti HIV sa zisťujú pomocou iných protilátok proti cieľovým protilátkam (protilátky proti iným protilátkam). Tieto pomocné protilátky sú označené enzýmom. Všetky skríningové testy musia byť vysoko citlivé, aby nezmeškali pacienta. Z tohto dôvodu ich špecifickosť nie je príliš vysoká, to znamená, že ELISA môže poskytnúť pozitívnu odpoveď („pravdepodobne chorá“) u neinfikovaných ľudí (napríklad u pacientov s autoimunitnými ochoreniami: reumatizmus, systémový lupus erythematosus atď.). Frekvencia falošne pozitívnych výsledkov pri použití rôznych testovacích systémov sa pohybuje od 0,02 do 0,5 %. Ak je test ELISA osoby pozitívny, potom na potvrdenie skutočnosti infekcie HIV je potrebné ďalšie vyšetrenie. Pri vykonávaní ELISA sú možné falošne negatívne výsledky v 3 - 5% prípadov - ak sa infekcia vyskytla relatívne nedávno a hladina protilátok je stále veľmi nízka, alebo v terminálnom štádiu ochorenia, ktoré sa vyznačuje závažným poškodením imunitného systému. systém s hlbokým narušením procesu tvorby protilátok. Preto, ak existujú dôkazy o kontakte s HIV infikovanými, opakované vyšetrenia sa zvyčajne vykonávajú po 2 až 3 mesiacoch.
II etapa - imunoblotovanie(v modifikácii Western Blot, Western blot): je komplexnejšia metóda a slúži na potvrdenie faktu infekcie. Táto metóda nedeteguje komplexné protilátky proti HIV, ale protilátky proti jednotlivým štruktúrnym proteínom (p24, gp120, gp41 atď.). Výsledky imunoblotingu sa považujú za pozitívne, ak sa detegujú protilátky aspoň proti trom proteínom, z ktorých jeden je kódovaný génmi env, druhý génmi gag a tretí génmi pol. Ak sa zistia protilátky proti jednému alebo dvom proteínom, výsledok sa považuje za nejednoznačný a vyžaduje potvrdenie. Vo väčšine laboratórií je infekcia HIV diagnostikovaná, ak sa súčasne detegujú protilátky proti proteínom p24, p31, gp4l a gpl20 / gp160. Podstata metódy: vírus je zničený na zložky (antigény), ktoré pozostávajú z ionizovaných zvyškov aminokyselín, a preto majú všetky zložky iný úsvit; potom sa pomocou elektroforézy (elektrický prúd) antigény rozložia na povrch prúžku – ak sú v testovacom sére protilátky proti HIV, budú interagovať so všetkými skupinami antigénov, čo sa dá zistiť.
Malo by sa to pamätaťže HIV protilátky sa objavia u 90-95% infikovaných ľudí do 3 mesiacov po infekcii, u 5-9% infikovaných HIV protilátky sa objavia po 6 mesiacoch a u 0,5-1% infikovaných HIV protilátky sa objavia neskôr. V štádiu AIDS sa môže počet protilátok znižovať až do úplného vymiznutia.
V imunológii existuje taká koncepcia ako Sérologické okienko - obdobie od infekcie do objavenia sa takého množstva protilátok, ktoré je možné zistiť. V prípade HIV toto obdobie zvyčajne trvá od 2 do 12 týždňov, v ojedinelých prípadoch aj dlhšie. V období „sérologického okna“ je podľa rozborov človek zdravý, no v skutočnosti je infikovaný HIV. Zistilo sa, že DNA HIV môže byť v ľudskom genóme najmenej tri roky bez známok aktivity a protilátky proti HIV (markery infekcie HIV) sa neobjavujú.
V tomto období („sérologické okno“) je možné identifikovať HIV infikovanú osobu a aj 1-2 týždne po infekcii je možné pomocou tzv. polymerická reťazová reakcia(PCR). Ide o mimoriadne citlivú metódu – teoreticky je možné detegovať 1 DNA na 10 ml média. Podstata metódy je nasledovná: pomocou polymerázovej reťazovej reakcie sa získa veľa kópií nukleovej kyseliny (vírus je nukleová kyselina - DNA alebo RNA - v proteínovom obale), ktoré sa potom detegujú pomocou značených enzýmov alebo izotopov , ako aj ich charakteristickou štruktúrou. PCR je drahá diagnostická metóda, preto sa v skríningu a rutinne nepoužíva.
DEFINÍCIA ŠTÁDIA OCHORENIA
Základom rozvoja AIDS je v prvom rade deštrukcia pomocných T-lymfocytov, označených monoklonálnymi protilátkami - diferenciačnými zhlukmi - ako CD4. V tomto ohľade je diagnostika a sledovanie progresie ochorenia nemožné bez monitorovania subpopulácie T-pomocníkov, čo sa najpohodlnejšie uskutočňuje pomocou laserového triediča buniek.
S miernou infekciou HIV počet T-lymfocytov je mimoriadne premenlivý ukazovateľ. Vo všeobecnosti sa zníženie počtu buniek CD4 (absolútne a relatívne) zisťuje u ľudí, ktorí sa nakazili vírusom HIV najmenej pred rokom. Na druhej strane, v počiatočných štádiách infekcie je počet T-supresorov (CD8) často prudko zvýšený ako v periférnej krvi, tak aj v zväčšených lymfatických uzlinách.
S ťažkým AIDS prevažná väčšina pacientov má znížený celkový počet T-lymfocytov (menej ako 1000 v 1 μl krvi vrátane CD4 lymfocytov - menej ako 22 v 1 μl, pričom absolútna hodnota obsahu CD8 zostáva v rámci normy). V súlade s tým pomer CD4 / CD8 prudko klesá. In vitro odpoveď T-lymfocytov na štandardné antigény a mitogény je znížená v prísnom súlade s relatívne zníženým počtom CD4.
Pre neskoré štádiá AIDS charakterizovaná všeobecnou lymfopéniou, neutropéniou, trombocytopéniou (resp. poklesom počtu lymfocytov, neutrofilov a krvných doštičiek), anémiou. Tieto zmeny môžu byť dôsledkom centrálnej inhibície hematopoézy v dôsledku poškodenia krvotvorných orgánov vírusom, ako aj autoimunitnej deštrukcie bunkových subpopulácií na periférii. Okrem toho je AIDS charakterizovaný miernym zvýšením množstva gama globulínov s dominantným zvýšením obsahu IgG. Pacienti so závažnými príznakmi AIDS majú často zvýšené hladiny IgA. V niektorých štádiách ochorenia sa výrazne zvyšuje hladina takých markerov AIDS, ako je 1-mikroglobulín, interferón stabilný v kyslom prostredí, 1-tymozín. To isté sa deje so sekréciou voľného neopterínu, metabolitu makrofágov. Zatiaľ nie je možné posúdiť relatívny význam každého z uvedených testov, ktorých počet neustále narastá. Preto by sa mali zvážiť v interakcii s markermi infekcie HIV imunovirologickej aj cytologickej povahy. Pre klinický krvný test je charakteristická leukopénia, lymfopénia (respektíve zníženie počtu leukocytov a lymfocytov).
Fáza 1 - " inkubačné štádium»
- protilátky proti HIV ešte neboli zistené; diagnóza infekcie HIV v tomto štádiu sa robí na základe epidemiologických údajov a musí byť laboratórne potvrdená detekciou vírusu ľudskej imunodeficiencie, jeho antigénov, nukleových kyselín HIV v krvnom sére pacienta;
Fáza 2 - " štádium primárnych prejavov»
- v tomto období už dochádza k tvorbe protilátok:;
Fáza 2A - " asymptomatické»
- HIV infekcia sa prejavuje len tvorbou protilátok;
Fáza 2B - " akútna infekcia HIV bez sekundárnych ochorení»
- široko-plazmatické lymfocyty - v krvi pacientov sa môžu nachádzať "mononukleárne bunky" a často dochádza k prechodnému poklesu hladiny CD4-lymfocytov (akútnu klinickú infekciu pozorujeme u 50-90% infikovaných jedincov v prvých 3 mesiace po infekcii; nástup obdobia akútnej infekcie spravidla prevyšuje sérokonverziu, t.j. výskyt protilátok proti HIV);
Fáza 2B - " akútna infekcia HIV so sekundárnymi ochoreniami»
- na pozadí poklesu hladiny CD4-lymfocytov az toho vyplývajúcej imunodeficiencie sa objavujú sekundárne ochorenia rôznej etiológie (tonzilitída, bakteriálna a pneumocystická pneumónia, kandidóza, herpetická infekcia atď.);
Fáza 3 - " latentný»
- v reakcii na progresiu imunodeficiencie je imunitná odpoveď modifikovaná vo forme nadmernej reprodukcie CD4 buniek, po ktorej nasleduje postupné znižovanie hladiny CD4 lymfocytov, v priemere rýchlosťou 0,05-0,07x109/l za rok ; protilátky proti HIV sa nachádzajú v krvi;
Fáza 4 - " štádiu sekundárnych chorôb»
- deplécia lymfocytov populácie CD4, výrazne sa znižuje koncentrácia protilátok proti vírusu (v závislosti od závažnosti sekundárnych ochorení sa rozlišujú štádiá 4A, 4B, 4B);
Fáza 5 - " terminálne štádium»
- typicky zníženie počtu CD4 buniek pod 0,05x109/l; koncentrácia protilátok proti vírusu je výrazne znížená alebo protilátky nemusia byť zistené.