Pri diagnostiki nalezljivih bolezni se uporabljajo različne laboratorijske metode za odkrivanje patogenov. Eden najbolj progresivnih, specifičnih in natančnih laboratorijskih testov je analiza PCR, ki vam omogoča ugotavljanje prisotnosti patogenov v krvi in drugih vrstah biološkega materiala, za odkrivanje mikroorganizmov v zgodnjih fazah razvoja bolezni, v primerih okužbe.
PCR analiza na posebni opremi
Kako se izvajajo diagnostični testi s PCR?
Verižna reakcija s polimerazo je laboratorijska molekularno biološka metoda za odkrivanje DNK bakterij in gliv, DNK in RNA virusov. Osnova PCR je posebna encimska reakcija, ki se pojavi v prisotnosti posebnih encimov in snovi molekularne narave. Zaradi dejstva, da je metoda sposobna neposredno določiti prisotnost povzročitelja bolezni, velja za najbolj informativno in občutljivo pri odkrivanju latentnih okužb in prenosa v primerjavi z vsemi drugimi diagnostičnimi metodami.
Analiza bioloških vzorcev s PCR testiranjem vam omogoča hitro odkrivanje prisotnosti samih bakterij in virusov.
Druge laboratorijske diagnostične metode praviloma ugotavljajo posredne znake okužbe ali zahtevajo dolgotrajen testni postopek.
Glavne faze tehnike PCR so:
- odvzem biološkega materiala, ki ga dostavi v diagnostični laboratorij,
- izolacijo genskega materiala bakterij in virusov od odvzetega materiala,
- neposredna analiza PCR in dekodiranje pridobljenih podatkov.
Za vzpostavitev PCR reakcije se uporabljajo vzorci tekočin, tkiv, skrivnosti, v katerih se domneva prisotnost patogenov. Najpogosteje uporabljeni vzorci za testiranje so venska kri, plazma ali serum. V laboratoriju bakterijske in virusne delce ločimo od drugih komponent in s posebnimi reagenti iz njih izoliramo molekule DNK ali RNA.
Verižna reakcija s polimerazo
Na naslednji stopnji se te genetske molekule večkrat pomnožijo v posebnih napravah. Če želite to narediti, uporabite posebne encime in molekule, ki vam omogočajo umetno razmnoževanje strogo določene vrste DNK, ki pripada samo enemu določenemu patogenu. Kot rezultat reakcije nastane ogromno število kratkih fragmentov DNK, enakih tistim, ki so del virusov in bakterij.
Na tretji stopnji se nakopičeni drobci odkrijejo s posebnimi barvili in opremo za odkrivanje. Če je prvotni vzorec vseboval patogene, se kot posledica reakcije tvori specifičen produkt in analiza pokaže pozitiven rezultat. Če patogen ni bil v materialu, se reakcijski produkt ne sintetizira in test daje negativen rezultat.
PCR testiranje je eden najhitrejših načinov za diagnosticiranje okužb. Celoten cikel preverjanja materiala traja od nekaj ur do enega dneva.
Metoda PCR - bistvo
Prav uporaba v reakciji večkratne reprodukcije molekul DNK strogo določenega tipa omogoča natančno določitev prisotnosti mikroorganizmov v bioloških vzorcih z izjemno občutljivostjo. Že majhna koncentracija povzročiteljev okužb v tkivih in telesnih tekočinah lahko privede do sinteze ogromne količine reakcijskega produkta in pozitivnega zaključka.
Katere okužbe ugotovimo s PCR testom
S tehnologijo PCR se odkrije prisotnost najrazličnejših bakterij, kvasovk podobnih celic, virusnih delcev. V sodobni diagnostični praksi je PCR analiza najpogostejša za identifikacijo povzročiteljev naslednjih bolezni:
- okužba s HIV (AIDS),
- hepatitis (hepatitis B, hepatitis C in druge redkejše vrste),
- okužba s citomegalovirusom,
- skoraj vse nalezljive bolezni genitourinarnega trakta,
- kandidiaza,
- mikoplazmoza,
- okužbe, ki jih povzročajo virusi herpesa,
- okužba s papiloma virusom,
- toksoplazmoza,
- črevesne bolezni,
- davica,
- tuberkuloza,
- redke žariščne okužbe,
- mononukleoza in mnogi drugi.
Verižna reakcija s polimerazo je najpogostejša, zanesljiva in hitra metoda za odkrivanje genitalnih okužb, hepatitisa, HIV, papiloma in drugih bolezni.
Za številne diagnosticirane bolezni PCR ni edini način za diagnosticiranje. Diagnozo zdravnik potrdi šele, ko opazimo druge znake bolezni.
Shema za odkrivanje virusov in bakterij
Toda v številnih primerih je reakcija polimeraze "zlati standard" laboratorijske diagnostike.
Seznam okužb, odkritih s PCR, se vsako leto širi. Razvoj metode je že omogočil hkratno določitev več patogenov. To je služilo za razširjanje obsežnih programov raziskav. Med njimi: celovita študija mikroflore za bakterijsko vaginozo, določanje okužb s TORCH, identifikacija človeških papilomov z visokim in nizkim rakotvornim tveganjem. Poleg tega je krvni test PCR vključen v obvezni bolnišnični diagnostični kompleks.
Znanstveniki so s polimerazno reakcijo lahko identificirali molekule, ki signalizirajo razvoj različnih oblik malignih tumorjev – tumorskih markerjev. Zahvaljujoč temu je metoda našla uporabo pri zgodnjem odkrivanju raka. PCR testi se aktivno uporabljajo za odkrivanje dednih genetskih napak, tudi pri prenatalni diagnostiki in med načrtovanjem nosečnosti.
Značilnosti biološkega materiala za PCR analizo
Zbiranje določene vrste materiala za raziskavo določa vrsta okužbe, ki jo želijo diagnosticirati kot rezultat testiranja. Kot preskusni vzorci se vzamejo naslednji vzorci:
- venska kri
- slina,
- strganje, na primer iz kanala materničnega vratu, z notranje strani lica,
- vzorci sluzi,
- urin,
- plevralna tekočina
- seme in izločki prostate,
- sputum in bronho-pljučna lavaža,
- izcedek iz sečnice.
Rezultate lahko dešifrirajo samo strokovnjaki
Za posamezne okužbe in za posebne indikacije lahko zdravniki predpišejo preiskavo likvorja. Pri odkrivanju intrauterinih bolezni se uporabljajo vzorci posteljice in amnijske tekočine.
Na splošno se za diagnostiko s PCR uporablja vrsta materiala, v katerem je najverjetneje prisoten povzročitelj same bolezni. Vrsto biološkega materiala določi zdravnik ob sklicevanju na analizo.
Za natančno in pravilno analizo je potrebna enostavna priprava pred vzorčenjem materiala in upoštevanje posebne čistosti jemanja vzorcev in same analize.
Da bi dobili natančen rezultat analize, se morate držati več pravil za pripravo in zbiranje gradiva za raziskave:
- odpoved spolnega odnosa nekaj dni pred odvzemom materiala iz genitalij in v primeru diagnosticiranja genitalnih okužb s krvno preiskavo,
- zjutraj vzemite vensko kri za analizo PCR, pred porodom ne uživajte pijače in hrane,
- ne kadite vsaj dve uri pred darovanjem krvi,
- Takoj po spanju strogo zbirajte urin v sterilno posodo.
Pomembno! Jemanje antibiotikov in drugih zdravil lahko izkrivlja rezultate testov. Pred oddajo gradiva se posvetujte s svojim zdravnikom.
Če je za izvedbo analize PCR načrtovan odvzem materiala iz genitalij, je priporočljivo, da po posvetovanju z zdravnikom prekličete uporabo antibakterijskih higienskih izdelkov in močnih zdravil.
Kako razvozlati rezultat PCR analize
Rezultati PCR so običajno predstavljeni v kvalitativni obliki. Infekcijski povzročitelj se bodisi odkrije v vzorcu biološkega materiala ali pa v njem ni odkrit.
Razlaga sklepa v tem primeru je čim enostavnejša:
- pozitiven rezultat kaže, da je bil mikroorganizem prisoten v analiziranem vzorcu,
- negativni test kaže, da ni bil odkrit noben povzročitelj okužbe.
Pozor! Negativen rezultat je včasih posledica nepravilnega vzorčenja ali napak v procesu analize.
V primeru očitnih simptomov bolezni in suma na lažno negativne rezultate je morda priporočljivo ponoviti študijo.
Analiza PCR zahteva veliko natančnost
V posebnih primerih se za določitev patogena uporabljajo kvantitativne metode. Rezultati takšnih analiz se izdajo v obliki dobljene koncentracije DNK ali RNA patogena glede na določeno količino materiala. Na primer, v kopijah molekul DNK na mililiter krvne plazme.
S kvantitativno in polkvantitativno analizo PCR ter interpretacijo njenih rezultatov spremljamo potek bolezni, določamo virusno obremenitev, ugotavljamo stadij bolezni in diagnosticiramo bolezni, ki jih povzročajo pogojni patogeni.
Pozitivni vidiki PCR diagnostike
Aktivna uvedba metode verižne reakcije s polimerazo pri diagnosticiranju tako širokega spektra nalezljivih bolezni je postala možna zaradi številnih njenih prednosti:
- visoka specifičnost metode - analiza vam omogoča odkrivanje strogo določene vrste DNK patogenov,
- sposobnost postavitve analize na tok in avtomatizacije procesa,
- visoka občutljivost metode in sposobnost diagnosticiranja bolezni v zgodnjih fazah,
- diagnosticiranje več okužb hkrati;
- hitrost postopka in nizki stroški potrošnega materiala.
Pomanjkljivosti metode vključujejo potrebo po dragi opremi, visoke zahteve za čistost in proizvodnost laboratorija, možnost pridobitve napačnih rezultatov, če se analizna metoda ne upošteva.
Za ustrezno in učinkovito zdravljenje številnih nalezljivih bolezni je potrebna pravočasna postavitev natančne diagnoze. Pri reševanju tega problema so danes vključene visokotehnološke diagnostične metode, ki temeljijo na metodah molekularne biologije. Trenutno se polimerazna verižna reakcija (PCR) že široko uporablja v praktični medicini kot najbolj zanesljivo orodje za laboratorijsko diagnostiko.
Kaj pojasnjuje priljubljenost PCR v tem času?
Prvič, ta metoda se uporablja za prepoznavanje povzročiteljev različnih nalezljivih bolezni z visoko natančnostjo.Drugič, spremljati učinkovitost zdravljenja.
V različnih priročnikih, brošurah, člankih, pa tudi v pojasnilih zdravnikov specialistov pogosto naletimo na uporabo nerazumljivih izrazov in besed. O visokotehnoloških produktih znanosti je res težko govoriti z navadnimi besedami.
Kaj je bistvo in mehanika PCR diagnostike?
Vsak živi organizem ima svoje edinstvene gene. Geni se nahajajo v molekuli DNK, ki je pravzaprav "klicna kartica" vsakega posameznega organizma. DNK (genetski material) je zelo dolga molekula, sestavljena iz gradnikov, imenovanih nukleotidi. Za vsakega povzročitelja nalezljivih bolezni se nahajajo strogo specifično, torej v določenem zaporedju in kombinaciji. Ko je treba ugotoviti, ali ima oseba določen patogen, se vzame biološki material (kri, urin, slina, bris), ki vsebuje DNK ali DNK fragmente mikroba. Toda količina genskega materiala patogena je zelo majhna in nemogoče je reči, kateremu mikroorganizmu pripada. Za rešitev tega problema se uporablja PCR. Bistvo polimerazne verižne reakcije je, da se vzame majhna količina materiala za raziskavo, ki vsebuje DNK, med postopkom PCR pa se poveča količina genskega materiala, ki pripada določenemu patogenu, in ga je tako mogoče identificirati.PCR diagnostika je genetska študija biomateriala.
Ideja metode PCR pripada ameriškemu znanstveniku K. Mullinsu, ki jo je predlagal leta 1983. Vendar pa je široko klinično uporabo dobil šele sredi 90-ih let XX stoletja. Ugotovimo terminologijo, kaj je to - DNK itd. Vsaka celica katerega koli živega bitja (žival, rastlina, človek, bakterija, virus) ima kromosome. Kromosomi so skrbniki genetskih informacij, ki vsebujejo celotno zaporedje genov vsakega posameznega živega bitja.
Vsak kromosom je sestavljen iz dveh verig DNK, zasukanih v vijačnico drug glede na drugega. DNK je kemično deoksiribonukleinska kislina, ki je sestavljena iz strukturnih komponent – nukleotidov. Obstaja 5 vrst nukleotidov - timin (T), adenozin (A), gvanin (G), citozin (C) in uracil (U). Nukleotidi se nahajajo drug za drugim v strogem posameznem zaporedju in tvorijo gene. En gen je lahko sestavljen iz 20-200 takih nukleotidov. Na primer, gen za proizvodnjo insulina je dolg 60 baznih parov.
Nukleotidi imajo lastnost komplementarnosti. To pomeni, da je nasproti adenina (A) v eni verigi DNK nujno timin (T) v drugi verigi in nasproti gvaninu (G) - citozin (C). Shematično izgleda takole:
G - C
T - A
A - T
Ta lastnost komplementarnosti je ključna za PCR.
Poleg DNK ima RNA enako strukturo – ribonukleinsko kislino, ki se od DNK razlikuje po tem, da namesto timina uporablja uracil. RNA - je skrbnik genetskih informacij v nekaterih virusih, imenovanih retrovirusi (na primer HIV).
Molekule DNK in RNA se lahko "množijo" (ta lastnost se uporablja za PCR). To se zgodi takole: dve verigi DNK ali RNA se odmakneta drug od drugega, na vsaki verigi sedi poseben encim, ki sintetizira novo verigo. Sinteza poteka po načelu komplementarnosti, to je, če je v prvotni verigi DNK nukleotid A, potem bo v novo sintetizirani T, če G - potem C itd. Ta poseben encim - "graditelj" za začetek sinteze potrebuje "seme" - zaporedje 5-15 nukleotidov. To "seme" je opredeljeno za vsak gen (gen za klamidijo, mikoplazma, virusi) eksperimentalno.
Torej je vsak cikel PCR sestavljen iz treh stopenj. V prvi fazi poteka tako imenovano odvijanje DNK – to je ločitev dveh povezanih verig DNK. V drugem primeru je "seme" pritrjeno na del verige DNK. In končno, podaljšanje teh verig DNK, ki ga proizvaja encim "graditelj". Trenutno celoten kompleksen proces poteka v eni epruveti in je sestavljen iz ponavljajočih se ciklov reprodukcije ugotovljene DNK z namenom pridobivanja velikega števila kopij, ki jih je nato mogoče odkriti z običajnimi metodami. To pomeni, da iz ene verige DNK dobimo na stotine ali tisoče.
Faze raziskave PCR
Zbiranje biološkega materiala za raziskave
Kot vzorec se uporabljajo različni biološki materiali: kri in njene sestavine, urin, slina, izcedek iz sluznice, cerebrospinalna tekočina, izcedek s površin ran in vsebina telesnih votlin. Vse biološke teste zberemo z instrumenti za enkratno uporabo, zbrani material pa zapremo v plastične sterilne epruvete ali položimo na gojišča, čemur sledi transport v laboratorij.Zbranim vzorcem dodamo zahtevane reagente in jih postavimo v programabilni termostat – termični cikel (ojačevalnik). V ojačevalniku se cikel PCR ponovi 30-50 krat, sestavljen iz treh stopenj (denaturacija, žarjenje in raztezanje). Kaj to pomeni? Poglejmo si natančneje.
Faze neposredne PCR reakcije, kopiranje genskega materiala
jazFaza PCR - Priprava genskega materiala za kopiranje.Pojavi se pri temperaturi 95 ° C, medtem ko so verige DNK ločene in na njih lahko sedejo "semena".
"Semena" industrijsko izdelujejo različna raziskovalna in proizvodna združenja, laboratorije pa kupujejo že pripravljene. Hkrati "seme" za odkrivanje, na primer, klamidije, deluje samo za klamidijo itd. Če torej biomaterial testiramo na prisotnost klamidijske okužbe, potem v reakcijsko mešanico damo "seme" za klamidijo; če je biomaterial testiran na virus Epstein-Barr, potem je tudi "seme" za virus Epstein-Barr.
IIfaza - Kombinacija genskega materiala povzročitelja okužbe in "semena".
Če obstaja DNK zaznanega virusa ali bakterije, se "seme" nahaja na tej DNK. Ta postopek pritrditve "primerja" je druga stopnja PCR. Ta faza poteka pri temperaturi 75 ° C.
IIIfaza - Kopiranje genskega materiala povzročitelja okužbe.
To je proces dejanskega podaljševanja ali razmnoževanja genskega materiala, ki se zgodi pri 72 °C. Encim "graditelj" se približa "semenu" in sintetizira novo verigo DNK. S koncem sinteze nove verige DNK se zaključi tudi cikel PCR. To pomeni, da se v enem ciklu PCR količina genskega materiala podvoji. Na primer, v prvotnem vzorcu je bilo 100 molekul DNK katerega koli virusa; po prvem ciklu PCR bo v vzorcu že 200 molekul DNK testiranega virusa. En cikel traja 2-3 minute.
Za pridobitev zadostne količine genskega materiala za identifikacijo se običajno izvede 30-50 ciklov PCR, kar traja 2-3 ure.
Faza identifikacije razmnoženega genskega materiala
Sam PCR se na tej točki konča, nato pa je enako pomembna faza identifikacije. Za identifikacijo se uporablja metoda elektroforeze ali označeni "primeri". Pri uporabi elektroforeze se pridobljene verige DNK ločijo po velikosti, prisotnost fragmentov DNK različnih dolžin pa kaže na pozitiven rezultat analize (to je prisotnost določenega virusa, bakterije itd.). Pri uporabi označenih "primerjev" se končnemu reakcijskemu produktu doda kromogen (barvilo), zaradi česar encimsko reakcijo spremlja tvorba barve. Razvoj barve neposredno nakazuje, da je v izvirnem vzorcu prisoten virus ali drugo zaznavno sredstvo. Danes je z uporabo označenih "primerjev" in ustrezne programske opreme mogoče takoj "prebrati" rezultate PCR. To je tako imenovani PCR v realnem času.
Zakaj je diagnostika PCR tako dragocena?
Ena od pomembnih prednosti metode PCR je njena visoka občutljivost - od 95 do 100%. Vendar bi morale te prednosti temeljiti na nepogrešljivem upoštevanju naslednjih pogojev:
- pravilno zbiranje, prevoz biološkega materiala;
- razpoložljivost sterilnih instrumentov za enkratno uporabo, posebnih laboratorijev in usposobljenega osebja;
- strogo upoštevanje tehnike in sterilnost med analizo
Zmogljivosti PCR analize vam omogočajo, da dosežete neprekosljivo analitično specifičnost. To pomeni, da natančno identificirate mikroorganizem, ki ste ga iskali, in ne podobnega ali tesno sorodnega.
Diagnostična občutljivost in specifičnost metode PCR sta pogosto boljša od metode kulture, imenovane "zlati standard" za odkrivanje nalezljivih bolezni. Glede na trajanje rasti kulture (od nekaj dni do nekaj tednov) postane prednost metode PCR očitna.
PCR pri diagnostiki okužb
Prednosti metode PCR (občutljivost in specifičnost) določajo širok spekter uporabe v sodobni medicini.
Glavna področja uporabe PCR diagnostike:
- diagnostika akutnih in kroničnih nalezljivih bolezni različnih lokalizacij
- spremljanje učinkovitosti terapije
- razjasnitev vrste patogena
Uporaba PCR diagnostike se izvaja v povezavi z drugimi raziskovalnimi metodami (ELISA, PIF, RIF itd.). Njihovo kombinacijo in ustreznost določi lečeči zdravnik.
Povzročitelji infekcij, odkriti s PCR
virusi:
- retrovirusa HIV-1 in HIV-2
- herpetiformni virusi
- virus herpes simpleksa tipa 1 in 2
Verižna reakcija s polimerazo (PCR, PCR - polimerazna verižna reakcija) je metoda pridobivanja več kopij specifičnih fragmentov DNA (genov) v biološkem vzorcu.
Bistvo PCR kot metode molekularne biologije je v večkratnem selektivnem kopiranju določenega gena (odseka DNK) z uporabo posebnih encimov pod pogoji. in vitro... Pomembna značilnost PCR je pridobivanje kopij določene regije DNK (gena), ki izpolnjuje določene pogoje. Sinonim za postopek kopiranja DNK je "amplifikacija". Replikacija DNK in vivo lahko štejemo tudi za ojačanje. Vendar pa se za razliko od replikacije kratki deli DNK (največ 40.000 baznih parov) med verižno reakcijo s polimerazo pomnožijo.
Osnovna načela
Torej, PCR je večkratno kopiranje določenih fragmentov DNK in vitro med ponavljajočimi se temperaturnimi cikli. Kako poteka reakcijski proces znotraj enega temperaturnega cikla?
Tvorbo nukleotidne verige izvaja encim DNA polimeraza. Vendar pa za začetek potrebuje encim izhodišče. Mesta so "primeri" (primers) - sintetični oligonukleotidi dolžine 15-20 nukleotidov. Primerja morata biti dva (naprej in nazaj), komplementarna sta regijam DNK predloge in DNK polimeraza bo večkrat kopirala fragment DNK, omejen s primerji. Delo polimeraze je zaporedno dodajanje nukleotidov, ki so komplementarni zaporedju DNK predloge. Tako se v enem temperaturnem ciklu ponovno sintetizirata dva nova fragmenta DNK (ker je molekula DNK dvoverižna, potem sta sprva dve matriki). Tako se v 25-35 ciklih v epruveti naberejo milijarde kopij regije DNK, ki jo določijo začetniki. Strukturo posameznega cikla lahko predstavimo na naslednji način:
- Denaturacija DNK (taljenje, razhajanje verig DNK) - 95 ° C - 1 ali 2 minuti;
- žarjenje primerjev (primeri se vežejo na DNK predlogo, temperatura te stopnje je določena z nukleotidno sestavo primerja) - 60 ° C (na primer) - 1 minuta;
- Raztezek DNK (polimeraza sintetizira verigo DNK) - 72 ° C - 1 minuta (čas je odvisen od dolžine sintetiziranega fragmenta).
Instrumentalna osnova za uporabo metode verižne reakcije s polimerazo v laboratoriju mora biti sestavljena iz:
- (ali, kot se imenuje tudi termični cikelr);
- sistemi za s (za vizualizacijo rezultatov PCR);
- sistemi (za analizo rezultatov PCR);
- (za pripravo vzorcev);
- klicanje (mehansko ali elektronsko).
Poleg glavne in pomožne opreme za popolno delovanje PCR laboratorija je potrebno nekaj potrošnega materiala: sterilne konice, epruvete, stojala za epruvete in razpršilniki.
Reagentna baza v običajnem PCR laboratoriju za izvedbo polnopravne polimerazne verižne reakcije vključuje encim DNA polimerazo s pufrom, primerje (majhne sintetične fragmente DNA, komplementarne začetku in koncu analizirane regije DNK predloge), mešanica nukleotidov (A, T, D, Ts). Prečiščena voda je prav tako nujno potrebna.
Prednosti metode PCR
Visoka občutljivost študije
Občutljivost metode je taka, da jo je mogoče pomnožiti v PCR in identificirati ciljno zaporedje, tudi če se pojavi enkrat v vzorcu 10 5 celic.
Specifičnost analize
PCR omogoča odkrivanje DNK določenega povzročitelja okužbe v prisotnosti DNK drugih mikroorganizmov in DNK gostiteljskega organizma, pa tudi genotipizacijo. S posebnim izborom reakcijskih komponent (primerov) lahko hkrati zaznate DNK tesno sorodnih mikroorganizmov.
Vsestranskost metode PCR
Dejstvo je, da je za PCR diagnostiko nalezljivih bolezni ali dednih bolezni človeka mogoče uporabiti eno in isto opremo, upoštevati univerzalne postopke za pripravo vzorcev (vzorcev) in analize ter isto vrsto kompletov reagentov.
Prihrani čas
Pomembna prednost PCR je odsotnost faz kulturnega mikrobiološkega dela. Priprava vzorcev, reakcija in analiza rezultatov so v mnogih pogledih maksimalno olajšani in avtomatizirani. Zahvaljujoč temu se lahko čas za doseganje rezultata zmanjša na 4-5 ur.
Učinkovitost metode PCR
Širina preučenega kliničnega materiala
Kot vzorec v polimerazni verižni reakciji se lahko uporabi ne le biološki material pacienta, temveč tudi številni drugi substrati, v katerih je mogoče identificirati molekule DNK z visoko občutljivostjo, na primer voda, zemlja, hrana, mikroorganizmi, izpiranje in še marsikaj. več....
Vse naštete prednosti te edinstvene metode - visoka občutljivost in specifičnost, identifikacija povzročitelja okužbe in genotipizacija katerega koli človeškega gena, visoka učinkovitost in prihranek časa, vsestranskost baze instrumentov - omogočajo, da se metoda PCR danes široko uporablja v klinični praksi. diagnostika, medicinska praksa, znanstvene raziskave, nadzor kakovosti in mnoga druga področja.
Aplikacija PCR
Področja uporabe polimerazne verižne reakcije kot sodobne metode molekularne biologije so raznolika. To je v veliki meri posledica širine materiala, ki ga je mogoče analizirati (predmet raziskovanja lahko postane skoraj vse, iz česar je mogoče izolirati bolj ali manj kakovostno DNK), pa tudi izbrani primerji. Glavna področja uporabe PCR:
klinična medicina
- diagnostiko nalezljivih bolezni
- diagnostika dednih bolezni
- identifikacija mutacij
- genotipizacija
- celične tehnologije
- izdelava genetskih potnih listov
ekologija
- spremljanje okolja
- analiza hrane
- analiza gensko spremenjenih organizmov (GSO)
sodna medicina in forenzika
- identifikacijo
- ugotavljanje očetovstva
farmakologija
veterinarski
znanstvene raziskave (molekularna biologija, genetika)
Organizacija PCR laboratorija
Informacije o naročilu
| ime | Glasnost | Proizvodnja | Metoda | Cat.številka |
|---|---|---|---|---|
Stran ponuja osnovne informacije samo v informativne namene. Diagnozo in zdravljenje bolezni je treba izvajati pod nadzorom specialista. Vsa zdravila imajo kontraindikacije. Potreben je strokovni posvet!
Metoda verižna reakcija s polimerazo je pred skoraj tridesetimi leti odkril ameriški znanstvenik z imenom Carrie Mullis... Tehnika je v medicini razširjena kot diagnostično orodje, njeno bistvo pa je kopiranje koščka DNK s pomočjo posebnega encima ( polimeraza) umetno v epruveti.Na katerih področjih medicine se ta metoda uporablja?
Zakaj se izvaja kopiranje DNK in kako lahko služi medicini?Ta tehnika omogoča:
- Izolirajte in klonirajte gene.
- Diagnoza genetskih in nalezljivih bolezni.
- Določite očetovstvo. Otrok delno podeduje genetske značilnosti od svojih bioloških staršev, hkrati pa ima svojo edinstveno genetsko identifikacijo. Prisotnost v njem nekaterih genov, enakih starševskim genom, nam omogoča, da govorimo o vzpostavitvi sorodstva.
Na kraju zločina forenziki zbirajo vzorce genskega materiala. Sem spadajo: lasje, slina, kri. Nato je s polimerazno reakcijsko tehniko mogoče pomnožiti DNK in primerjati identiteto odvzetega vzorca z genskim materialom osumljenca.
V medicini se polimerazna verižna reakcija učinkovito uporablja:
- V pljučni praksi - za diferenciacijo bakterijskih in virusnih vrst pljučnice, tuberkuloze.
- V ginekološki in urološki praksi - za določitev ureaplazmoze, klamidije, okužbe z mikoplazmo, gardnereloze, herpesa, gonoreje.
- V gastroenterološki praksi.
- V hematologiji - za določanje onkovirusov in okužbe s citomegalovirusom.
- Pri hitri diagnostiki nalezljivih bolezni, kot so virusni hepatitis, davica, salmoneloza.
Trenutno je ta metoda najpogostejša pri diagnostiki nalezljivih bolezni ( hepatitis virusne etiologije, HIV, spolno prenosljive bolezni, tuberkuloza, klopni encefalitis).
Kaj se zgodi med reakcijo?
Sama reakcija je kemično nezapletena. Vir DNK za reakcijo je lahko kapljica krvi, las, kos kože itd. V teoriji reakcija zahteva prave reagente, epruveto, biološki vzorec in vir toplote. Polimerazna reakcija omogoča odkrivanje okužbe, tudi če je v vzorcu z biološkim materialom le ena ali več molekul DNK patogena.
Med potekom reakcije se zaradi encima DNA polimeraze podvoji ( replikacijo) kos DNK. Povsem ista deoksiribonukleinska kislina ( skrajšana DNK) je za nas pomemben, ker zagotavlja shranjevanje in prenos genetskih informacij v hčerinske celice. DNK ima obliko spirale, ki je sestavljena iz ponavljajočih se blokov. Ti bloki sestavljajo nukleotide, ki so najmanjši del DNK. Nukleotidi nastanejo iz aminokislin.
Proces replikacije odsekov DNK poteka med ponavljajočimi se cikli. V vsakem takem ciklu se ne kopira in podvoji le originalni fragment DNK, temveč tudi tisti fragmenti, ki so se že podvojili v zadnjem ciklu pomnoževanja. Vse to spominja na proces geometrijske progresije.
Obstaja:
- Naravno ojačanje ( to je proces kopiranja in razmnoževanja DNK), ki se pojavlja v našem telesu in je determinističen, vnaprej določen proces.
- Umetno ojačanje, ki se pojavi s polimerazno verižno reakcijo. V tem primeru je postopek kopiranja nadzorovan in omogoča podvajanje celo kratkih delov nukleinske kisline.
Trideset ali štirideset ciklov kasneje število fragmentov doseže več milijard.
Za ojačanje in vitro (in vitro) potrebno je, da je specifičen tuji fragment DNK ( to pomeni, da DNK ni bolnika, ampak patogena). Če v ustvarjeni raztopini ni specifičnega fragmenta, se verižna reakcija pod delovanjem polimeraze ne bo nadaljevala. To pojasnjuje visoko specifičnost PCR.
Faze PCR diagnostike
1. DNK se izolira iz testnega materiala.2. DNK dodajte posebni raztopini nukleotidov.
3. Raztopino segrejemo na temperaturo 90 - 95 stopinj Celzija, da se protein DNK koagulira.
4. Zmanjšajte temperaturo na 60 stopinj.
5. S ponavljanjem ciklov dviga in zniževanja temperature se poveča število regij nukleinske kisline.
6. Rezultate seštejemo z elektroforezo in izračunamo rezultate podvojitve.
Kakšne so prednosti te diagnoze?
- Vsestranskost: Za to metodo je primeren kateri koli vzorec nukleinske kisline.
- Visoka specifičnost: povzročitelj ima edinstvena zaporedja verig DNK, ki so zanj značilna. Zato bodo rezultati izvedene PCR zanesljivi, gena enega patogena ni mogoče zamenjati z genom drugega patogena.
- Občutljivost na prisotnost celo ene molekule patogena.
- Za raziskavo je potrebna majhna količina materiala. Tudi kapljica krvi bo dovolj. Sposobnost pridobivanja rezultata z minimalno količino vzorca je zelo pomembna za pediatrične, neonatološke, nevrološke raziskave, pa tudi v praksi sodne medicine.
- Sposobnost prepoznavanja počasne, kronične okužbe in ne le akutne.
- Veliko kultur, ki povzročajo bolezni, je zelo težko gojiti in vitro z drugimi metodami, polimerazna reakcija pa omogoča razmnoževanje kulture v zahtevani količini.
Kakšne so slabosti te diagnoze?
- Če material, namenjen PCR, vsebuje DNK ne le živega patogena, ampak tudi umrlega, bo prišlo do pomnoževanja obeh DNK. Zato zdravljenje po diagnozi morda ni povsem pravilno. Čez nekaj časa je bolje preveriti učinkovitost zdravljenja.
- Preobčutljivost na prisotnost mikroorganizmov se lahko na nek način šteje za slabost. Dejansko je v človeškem telesu običajno pogojno patogena mikroflora, torej mikroorganizmi, ki živijo v črevesju, želodcu in drugih notranjih organih. Ti mikroorganizmi lahko škodijo osebi le pod določenimi neugodnimi pogoji - neupoštevanje higienskih zahtev, onesnažena pitna voda itd. Tehnika PCR pomnožuje DNK celo teh mikroorganizmov, čeprav ne vodijo v patologijo.
- PCR različnih testnih sistemov lahko pokaže rezultate, ki se med seboj razlikujejo. Obstaja veliko modifikacij te tehnike: " ugnezdene», « asimetrično», « obrnjeno», « kvantitativno»PCR in drugi.