Sa pagsusuri ng mga nakakahawang sakit, iba't ibang mga pamamaraan sa laboratoryo para sa pagtuklas ng mga pathogens ang ginagamit. Ang isa sa pinaka-progresibo, tiyak at tumpak na mga pagsubok sa laboratoryo ay ang pagsusuri sa PCR, na nagbibigay-daan sa iyo upang matukoy ang pagkakaroon ng mga pathogens sa dugo at iba pang mga uri ng biological material, upang makita ang mga mikroorganismo sa maagang yugto ng pag-unlad ng sakit, sa mga kaso ng impeksyon.
Pagsusuri ng PCR sa mga espesyal na kagamitan
Paano ginagawa ang mga pagsusuri sa diagnostic gamit ang PCR
Ang reaksyon ng Polymerase chain ay isang pamamaraan ng biological biological na laboratoryo para sa pagtuklas ng DNA ng bakterya at fungi, DNA at RNA ng mga virus. Ang batayan ng PCR ay isang espesyal na reaksyon ng enzymatic na nangyayari sa pagkakaroon ng mga espesyal na enzyme at sangkap ng isang likas na molekula. Dahil sa ang katunayan na ang pamamaraan ay magagawang ayusin ang pagkakaroon ng causative ahente ng sakit nang direkta, ito ay itinuturing na ang pinaka-kaalaman at sensitibo sa pagtuklas ng mga nakatago impeksyon at karwahe kumpara sa lahat ng iba pang mga pamamaraan ng diagnostic.
Ang pagsusuri ng mga biological sample na gumagamit ng pagsusuri sa PCR ay nagbibigay-daan sa iyo upang mabilis na makita ang pagkakaroon ng mga bakterya at mga virus mismo.
Ang iba pang mga pamamaraan ng diagnostic ng laboratoryo, bilang panuntunan, ay tumutukoy sa hindi direktang mga palatandaan ng impeksyon, o nangangailangan ng isang mahabang pamamaraan ng pagsubok.
Ang mga pangunahing yugto ng diskarteng PCR ay:
- pagkuha ng biological material, ihahatid ito sa diagnostic laboratoryo,
- paghihiwalay ng genetikong materyal ng bakterya at mga virus mula sa materyal na kinuha,
- direktang pagtatasa ng PCR at pag-decode ng nakuha na data.
Upang mag-set up ng isang reaksyon ng PCR, ginagamit ang mga sample ng likido, tisyu, lihim, kung saan ipinapalagay ang pagkakaroon ng mga pathogens. Ang pinakakaraniwang ginagamit na mga sample para sa pagsubok ay ang venous blood, plasma, o suwero. Sa laboratoryo, ang mga particle ng bakterya at viral ay pinaghihiwalay mula sa iba pang mga bahagi at, gamit ang mga espesyal na reagent, ang mga molekula ng DNA o RNA ay ihiwalay mula sa kanila.
Reaksyon ng polymerase chain
Sa susunod na yugto, ang mga genetic molekula na ito ay pinarami ng maraming beses sa mga espesyal na aparato. Upang magawa ito, gumamit ng mga espesyal na enzyme at molekula na nagbibigay-daan sa iyo upang artipisyal na paramihin ang isang mahigpit na tinukoy na uri ng DNA na kabilang sa isang tiyak na pathogen lamang. Bilang isang resulta ng reaksyon, isang malaking bilang ng mga maikling fragment ng DNA ang nabuo, magkapareho sa mga bahagi ng mga virus at bakterya.
Sa ikatlong yugto, ang naipon na mga fragment ay napansin na gumagamit ng mga espesyal na tina at kagamitan sa pagtuklas. Kung ang orihinal na sample ay naglalaman ng mga pathogens, isang tiyak na produkto ay nabuo bilang isang resulta ng reaksyon, at ang pagsusuri ay nagpapakita ng isang positibong resulta. Kung ang pathogen ay wala sa materyal, ang reaksyon na produkto ay hindi na-synthesize at ang pagsubok ay nagbibigay ng isang negatibong resulta.
Ang pagsusuri sa PCR ay isa sa pinakamabilis na paraan upang masuri ang mga impeksyon. Ang isang kumpletong siklo ng inspeksyon ng materyal ay tumatagal mula sa maraming oras hanggang isang araw.
Paraan ng PCR - ang kakanyahan
Ito ang paggamit sa reaksyon ng maraming pagpaparami ng mga molekula ng DNA ng isang mahigpit na tinukoy na uri na ginagawang posible upang tumpak na matukoy ang pagkakaroon ng mga mikroorganismo sa mga biological sample na may matinding pagkasensitibo. Kahit na ang isang maliit na konsentrasyon ng mga nakakahawang ahente sa mga tisyu at likido sa katawan ay maaaring humantong sa pagbubuo ng isang malaking halaga ng produktong reaksyon at isang positibong konklusyon.
Anong mga impeksyon ang natutukoy sa pagsusuri ng PCR
Gamit ang teknolohiyang PCR, napansin ang pagkakaroon ng iba't ibang uri ng bakterya, mga selulang tulad ng lebadura, mga viral na butil. Sa modernong kasanayan sa diagnostic, ang pagsusuri sa PCR ay pinaka-karaniwan upang makilala ang mga causative agents ng mga sumusunod na sakit:
- Impeksyon sa HIV (AIDS),
- hepatitis (hepatitis B, hepatitis C at iba pang mga bihirang uri),
- impeksyon sa cytomegalovirus,
- halos lahat ng mga nakakahawang sakit ng genitourinary tract,
- candidiasis,
- mycoplasmosis,
- mga impeksyon na dulot ng mga herpes virus,
- impeksyon sa papillomavirus,
- toxoplasmosis,
- sakit sa bituka,
- dipterya,
- tuberculosis,
- bihirang impeksyon sa focal,
- mononucleosis at marami pang iba.
Ang reaksyon ng polymerase chain ay ang pinaka-karaniwan, maaasahan at mabilis na pamamaraan para sa pagtuklas ng mga impeksyon sa genital, hepatitis, HIV, papillomas at iba pang mga sakit.
Para sa maraming mga sakit na nasuri, ang PCR ay hindi lamang ang paraan upang mag-diagnose. Ang diagnosis ay kumpirmado lamang ng isang doktor kapag ang iba pang mga palatandaan ng sakit ay sinusunod.
Skema ng pagtuklas ng virus at bakterya
Ngunit para sa isang bilang ng mga kaso, ang reaksyon ng polimerase ay ang "pamantayang ginto" ng mga diagnostic sa laboratoryo.
Ang listahan ng mga impeksyon na nakita ng PCR ay lumalawak bawat taon. Ang pag-unlad ng pamamaraan ay ginawang posible upang matukoy nang sabay-sabay ng maraming mga pathogens. Nagsilbi ito upang magpalaganap ng komprehensibong mga programa sa survey. Kabilang sa mga ito: isang komprehensibong pag-aaral ng microflora para sa bacterial vaginosis, pagpapasiya ng mga impeksyon sa TORCH, pagkilala sa mga papillomas ng tao na may mataas at mababang peligro sa carcinogenic. Bilang karagdagan, ang isang pagsusuri sa dugo ng PCR ay kasama sa ipinag-uutos na komplikadong mga diagnostic sa ospital.
Gamit ang reaksyon ng polymerase, nakilala ng mga siyentista ang mga molekula na hudyat sa pagbuo ng iba't ibang anyo ng mga malignant na bukol - mga marker ng tumor. Salamat dito, ang pamamaraan ay nakakita ng aplikasyon sa maagang pagtuklas ng cancer. Ang mga pagsusuri sa PCR ay aktibong ginagamit upang makita ang mga namamana na genetiko na depekto, kabilang ang mga prenatal diagnostic at habang nagpaplano ng pagbubuntis.
Mga tampok ng biological material para sa pagsusuri ng PCR
Ang koleksyon ng isang tiyak na uri ng materyal para sa pagsasaliksik ay natutukoy ng uri ng impeksyon na nais nilang masuri bilang isang resulta ng pagsubok. Ang mga sumusunod na sample ay kinuha bilang mga sample ng pagsubok:
- dugo ng venous
- laway,
- ang pag-scrape, halimbawa mula sa servikal na kanal, mula sa loob ng pisngi,
- mga sample ng uhog,
- ihi,
- pleural fluid
- mga pagtatago ng semilya at prosteyt,
- dura at broncho-pulmonary lavage,
- paglabas mula sa yuritra.
Ang mga resulta ay maaaring maintindihan lamang ng mga espesyalista
Para sa mga indibidwal na impeksyon at para sa mga espesyal na indikasyon, ang mga doktor ay maaaring magreseta ng pagsusuri sa cerebrospinal fluid. Sa pagtuklas ng mga sakit na intrauterine, ginagamit ang mga sample ng inunan at amniotic fluid.
Sa pangkalahatan, para sa mga diagnostic na gumagamit ng PCR, ang uri ng materyal ay ginagamit kung saan ang causative agent ng sakit mismo ay malamang na naroroon. Ang uri ng biological na materyal ay natutukoy ng doktor kapag tumutukoy sa pagtatasa.
Upang ang pagtatasa ay tumpak at tama, kailangan ng simpleng paghahanda bago ang sampling at pagsunod sa pinakamataas na kadalisayan ng pagkuha ng mga sample at pagsasagawa mismo ng pagsusuri.
Upang makakuha ng tumpak na resulta ng pagsusuri, dapat kang sumunod sa maraming mga patakaran para sa paghahanda at koleksyon ng materyal para sa pagsasaliksik:
- kanselahin ang pakikipagtalik ilang araw bago kumuha ng materyal mula sa maselang bahagi ng katawan at sa kaso ng pag-diagnose ng mga impeksyong genital sa pamamagitan ng pagsusuri sa dugo,
- kumuha ng venous blood para sa pagsusuri ng PCR sa umaga, huwag ubusin ang inumin at pagkain bago ihatid,
- huwag manigarilyo kahit dalawang oras bago magbigay ng dugo,
- Kolektahin ang ihi sa isang isterilisadong lalagyan kaagad pagkatapos matulog.
Mahalaga! Ang pag-inom ng antibiotics at iba pang mga gamot ay maaaring makapagpalit ng mga resulta sa pagsubok. Bago isumite ang materyal, dapat kang kumunsulta sa iyong doktor.
Kung para sa pagsasagawa ng pagsusuri ng PCR pinaplano itong kumuha ng materyal mula sa mga maselang bahagi ng katawan, inirerekumenda na kanselahin ang paggamit ng mga produktong kalinisan ng antibacterial at mga mabisang gamot na kumunsulta sa dumadating na manggagamot.
Paano maintindihan ang resulta ng pagsusuri ng PCR
Ang mga resulta ng PCR ay karaniwang ipinakita sa isang format na husay. Ang isang nakakahawang ahente ay maaaring napansin sa isang sample ng biological na materyal, o hindi nakita dito.
Ang interpretasyon ng konklusyon sa kasong ito ay kasing simple hangga't maaari:
- isang positibong resulta ay nagpapahiwatig na ang microorganism ay naroroon sa pinag-aralan na sample,
- isang negatibong pagsusuri ay nagpapahiwatig na walang nakitang nakakahawang ahente.
Pansin Ang isang negatibong resulta kung minsan ay resulta ng hindi tamang pag-sample o mga pagkakamali sa proseso ng pagtatasa.
Sa pagkakaroon ng halatang mga sintomas ng sakit at hinala ng isang maling negatibong resulta, maipapayo na ulitin ang pag-aaral.
Ang pagtatasa ng PCR ay nangangailangan ng mahusay na katumpakan
Sa mga espesyal na kaso, ginagamit ang mga pamamaraan ng dami upang matukoy ang pathogen. Ang mga resulta ng naturang mga pag-aaral ay inilabas sa anyo ng nakuha na konsentrasyon ng DNA o RNA ng pathogen sa mga tuntunin ng isang tiyak na dami ng materyal. Halimbawa, sa mga kopya ng mga molekulang DNA bawat milliliter ng plasma ng dugo.
Ang dami at semi-dami na PCR na pag-aaral at interpretasyon ng mga resulta ay isinagawa upang masubaybayan ang kurso ng sakit, matukoy ang viral load, kilalanin ang yugto ng sakit, at masuri ang mga sakit na sanhi ng mga kondisyonal na pathogens.
Positive na mga aspeto ng PCR diagnostic
Ang aktibong pagpapakilala ng paraan ng reaksyon ng polymerase chain sa pagsusuri ng tulad ng isang malawak na hanay ng mga nakakahawang sakit ay naging posible dahil sa isang bilang ng mga kalamangan:
- mataas na pagtutukoy ng pamamaraan - pinapayagan ka ng pagsusuri na makita ang isang mahigpit na tinukoy na uri ng DNA ng mga pathogens,
- ang posibilidad na itakda ang pagtatasa sa stream at i-automate ang proseso,
- mataas na pagiging sensitibo ng pamamaraan at ang kakayahang masuri ang sakit sa maagang yugto,
- mga diagnostic ng maraming mga impeksyon nang sabay-sabay;
- bilis ng pamamaraan at mababang halaga ng mga natupok.
Kabilang sa mga kawalan ng pamamaraan ang pangangailangan para sa mamahaling kagamitan, mataas na kinakailangan para sa kadalisayan at kakayahang gumawa ng laboratoryo, ang posibilidad na makakuha ng maling resulta kung hindi sundin ang pamamaraang pag-aaral.
Para sa sapat at mabisang paggamot ng maraming mga nakakahawang sakit, kinakailangan ang napapanahong pagtatatag ng isang tumpak na pagsusuri. Sa paglutas ng problemang ito, ang mga high-tech na pamamaraan ng diagnostic batay sa mga pamamaraan ng molekular biology ay kasangkot sa panahong ito. Sa ngayon, ang reaksyon ng polymerase chain (PCR) ay malawakang ginagamit sa praktikal na gamot bilang pinaka maaasahang tool para sa mga diagnostic ng laboratoryo.
Ano ang nagpapaliwanag ng katanyagan ng PCR sa kasalukuyang oras?
Una, ang pamamaraang ito ay ginagamit upang makilala ang mga causative agents ng iba't ibang mga nakakahawang sakit na may mataas na kawastuhan.Pangalawa, upang masubaybayan ang pagiging epektibo ng paggamot.
Sa iba't ibang mga manwal, brochure, artikulo, pati na rin ang mga paliwanag ng mga espesyalista sa medisina, madalas naming maabot ang paggamit ng hindi maunawaan na mga termino at salita. Mahirap talagang pag-usapan ang mga produktong high-tech ng agham sa pang-araw-araw na salita.
Ano ang kakanyahan at mekanika ng mga diagnostic ng PCR?
Ang bawat nabubuhay na organismo ay may sariling natatanging mga gen. Ang mga Genes ay matatagpuan sa Molekyul ng DNA, kung saan, sa katunayan, ang "calling card" ng bawat partikular na organismo. Ang DNA (genetic material) ay isang napakahabang Molekyul na binubuo ng mga bloke ng gusali na tinatawag na mga nucleotide. Para sa bawat causative agent ng mga nakakahawang sakit, matatagpuan ang mga ito nang mahigpit na partikular, iyon ay, sa isang tiyak na pagkakasunud-sunod at kumbinasyon. Kung kinakailangan upang maunawaan kung ang isang tao ay may isang partikular na pathogen, ang biological na materyal (dugo, ihi, laway, pahid) ay kinuha, na naglalaman ng mga fragment ng DNA o DNA ng microbe. Ngunit ang dami ng materyal na genetiko ng pathogen ay napakaliit, at imposibleng sabihin kung aling microorganism ito kabilang. Upang malutas ang problemang ito, ginagamit ang PCR. Ang kakanyahan ng reaksyon ng polymerase chain na ang isang maliit na halaga ng materyal para sa pananaliksik na naglalaman ng DNA ay kinuha, at sa panahon ng proseso ng PCR, ang pagtaas ng dami ng materyal na genetiko na kabilang sa isang tukoy na pathogen ay nangyayari at, sa gayon, maaari itong makilala.Ang mga diagnostic ng PCR ay isang pag-aaral ng genetiko ng isang biomaterial.
Ang ideya ng pamamaraang PCR ay pagmamay-ari ng Amerikanong siyentista na si K. Mullins, na iminungkahi niya noong 1983. Gayunpaman, nakatanggap ito ng malawak na aplikasyon ng klinikal lamang sa kalagitnaan ng dekada 90 ng siglo na XX. Alamin natin ang terminolohiya, ano ito - DNA, atbp. Ang bawat cell ng anumang nabubuhay (hayop, halaman, tao, bakterya, virus) ay may mga chromosome. Ang mga Chromosome ay mga tagapag-ingat ng impormasyong genetiko, na naglalaman ng buong pagkakasunud-sunod ng mga gen ng bawat partikular na nabubuhay na nilalang.
Ang bawat chromosome ay binubuo ng dalawang mga hibla ng DNA, na napilipit sa isang helix na may kaugnayan sa bawat isa. Ang DNA ay chemically deoxyribonucleic acid, na binubuo ng mga sangkap ng istruktura - mga nucleotide. Mayroong 5 uri ng mga nucleotide - thymine (T), adenosine (A), guanine (G), cytosine (C) at uracil (U). Ang mga Nucleotide ay matatagpuan isa-isa sa isang mahigpit na indibidwal na pagkakasunud-sunod, na bumubuo ng mga gen. Ang isang gene ay maaaring binubuo ng 20-200 tulad ng mga nucleotide. Halimbawa, ang pag-coding ng gene para sa produksyon ng insulin ay 60 base pares ang haba.
Ang Nucleotides ay may pag-aari ng pagkakumpleto. Nangangahulugan ito na kabaligtaran sa adenine (A) sa isang DNA strand mayroong kinakailangang thymine (T) sa iba pang strand, at kabaligtaran sa guanine (G) - cytosine (C). Ganito ang hitsura ng iskematika:
G - C
T - A
A - T
Ang pag-aari na ito ng pagkakumpleto ay susi para sa PCR.
Bilang karagdagan sa DNA, ang RNA ay may parehong istraktura - ribonucleic acid, na naiiba sa DNA na gumagamit ito ng uracil sa halip na thymine. Ang RNA - ay ang tagapag-alaga ng impormasyong genetiko sa ilang mga virus, na tinatawag na retrovirus (halimbawa, HIV).
Ang mga molekula ng DNA at RNA ay maaaring "dumami" (ang pag-aaring ito ay ginagamit para sa PCR). Nangyayari ito tulad ng sumusunod: dalawang hibla ng DNA o RNA na magkakalayo sa bawat isa, isang espesyal na enzyme ang nakaupo sa bawat hibla, na nagbubuo ng isang bagong hibla. Ang pagbubuo ay nagpapatuloy ayon sa prinsipyo ng pagkakaugnay, iyon ay, kung mayroong nucleotide A sa orihinal na DNA strand, kung gayon sa bagong na-synthesize ay magkakaroon ng T, kung G - pagkatapos ng C, atbp. Ang espesyal na enzyme - "tagabuo" para sa simula ng pagbubuo ay nangangailangan ng isang "binhi" - isang pagkakasunud-sunod ng 5-15 nucleotides. Ang "binhi" na ito ay tinukoy para sa bawat gene (chlamydia gene, mycoplasma, mga virus) sa eksperimento.
Kaya, ang bawat siklo ng PCR ay binubuo ng tatlong yugto. Sa unang yugto, nangyayari ang tinatawag na pag-unwind ng DNA - iyon ay, ang paghihiwalay ng dalawang naka-link na mga hibla ng DNA. Sa pangalawa, ang "binhi" ay nakakabit sa isang seksyon ng strand ng DNA. At, sa wakas, ang pagpapahaba ng mga DNA strands na ito, na ginawa ng "builder" na enzyme. Sa kasalukuyan, ang buong kumplikadong proseso na ito ay nagaganap sa isang test tube at binubuo ng paulit-ulit na siklo ng pagpaparami ng natukoy na DNA upang makakuha ng isang malaking bilang ng mga kopya, na maaaring makita ng mga maginoo na pamamaraan. Iyon ay, mula sa isang hibla ng DNA nakakakuha tayo ng daan-daan o libo.
Mga yugto ng pagsasaliksik sa PCR
Koleksyon ng biological material para sa pagsasaliksik
Bilang isang sample, iba't ibang mga biological na materyales ang ginagamit: dugo at mga bahagi nito, ihi, laway, mucous membrane debit, cerebrospinal fluid, paglabas mula sa mga sugat na ibabaw, ang nilalaman ng mga lukab ng katawan. Ang lahat ng mga bioassay ay nakolekta gamit ang mga hindi kinakailangan na instrumento, at ang nakolektang materyal ay nakapaloob sa mga plastik na sterile tubo o inilagay sa culture media, na sinusundan ng transportasyon sa laboratoryo.Ang mga kinakailangang reagent ay idinagdag sa mga nakolekta na mga sample at inilagay sa isang programmable termostat - isang thermal cycler (amplifier). Sa thermocycler, ang siklo ng PCR ay paulit-ulit na 30-50 beses, na binubuo ng tatlong yugto (denaturation, pagsusubo at pagpahaba). Ano ang ibig sabihin nito? Tingnan natin nang malapitan.
Mga yugto ng direktang reaksyon ng PCR, pagkopya ng materyal na genetiko
AkoPCR yugto - Paghahanda ng materyal na genetiko para sa pagkopya.Ito ay nangyayari sa temperatura na 95 ° C, habang ang mga hibla ng DNA ay pinaghiwalay, at ang "mga binhi" ay maaaring umupo sa kanila.
Ang "Binhi" ay gawa sa pang-industriya sa pamamagitan ng iba't ibang pagsasaliksik at mga asosasyon ng produksyon, at ang mga laboratoryo ay binili nang handa na. Sa parehong oras, ang "binhi" para sa pagtuklas, halimbawa, chlamydia, gumagana lamang para sa chlamydia, atbp. Kaya, kung ang isang biomaterial ay nasubok para sa pagkakaroon ng impeksyon sa chlamydial, kung gayon ang isang "binhi" para sa chlamydia ay inilalagay sa pinaghalong reaksyon; kung ang isang biomaterial ay nasubok para sa Epstein-Barr virus, pagkatapos ito ay isang "binhi" din para sa Epstein-Barr virus.
IIyugto - Pagsasama-sama ng materyal na genetiko ng nakakahawang ahente at ng "binhi".
Kung mayroong DNA ng napansin na virus o bakterya, ang "binhi" ay nakaupo sa DNA na ito. Ang prosesong ito ng paglakip ng "panimulang aklat" ay ang pangalawang yugto ng PCR. Ang yugtong ito ay nagaganap sa temperatura na 75 ° C.
IIIyugto - Pagkopya ng materyal na genetiko ng nakakahawang ahente.
Ito ang proseso ng talagang pagpapahaba o pagpaparami ng materyal na genetiko, na nangyayari sa 72 ° C. Ang "tagabuo" na enzyme ay lumalapit sa "mga binhi" at binubuo ng isang bagong hibla ng DNA. Sa pagtatapos ng pagbubuo ng isang bagong strand ng DNA, nagtatapos din ang siklo ng PCR. Iyon ay, sa isang siklo ng PCR, ang dami ng materyal na pang-genetiko ay dumoble. Halimbawa, sa orihinal na sample mayroong 100 mga DNA molekula ng anumang virus; pagkatapos ng unang pag-ikot ng PCR, magkakaroon na ng 200 DNA molekula ng nasubok na virus sa sample. Ang isang siklo ay tumatagal ng 2-3 minuto.
Upang makabuo ng isang sapat na halaga ng materyal na pang-henetiko para sa pagkakakilanlan, kadalasang 30-50 PCR cycle ang ginaganap, na tumatagal ng 2-3 na oras.
Yugto ng pagkakakilanlan ng pinalaganap na materyal na henetiko
Ang PCR mismo ay nagtatapos sa puntong ito, at pagkatapos ay mayroong isang pantay na makabuluhang yugto ng pagkakakilanlan. Para sa pagkilala, gamitin ang pamamaraan ng electrophoresis o may label na "primers". Kapag gumagamit ng electrophoresis, ang nakuha na mga hibla ng DNA ay pinaghihiwalay ng laki, at ang pagkakaroon ng mga fragment ng DNA na magkakaibang haba ay nagpapahiwatig ng isang positibong resulta ng pagsusuri (iyon ay, ang pagkakaroon ng isang partikular na virus, bakterya, atbp.). Kapag gumagamit ng may label na "primers", isang chromogen (tina) ay idinagdag sa pangwakas na reaksyon ng produkto, bilang isang resulta kung saan ang reaksiyong enzymatic ay sinamahan ng pagbuo ng isang kulay. Ang pagbuo ng kulay nang direkta ay nagpapahiwatig na ang isang virus o iba pang natukoy na ahente ay naroroon sa orihinal na sample. Ngayon, gamit ang may label na "primers", pati na rin ang naaangkop na software, agad na "mababasa" ang isang resulta ng PCR. Ito ang tinatawag na real-time PCR.
Bakit napakahalaga ng mga diagnostic ng PCR?
Ang isa sa mga makabuluhang bentahe ng pamamaraan ng PCR ay ang mataas na pagiging sensitibo - mula 95 hanggang 100%. Gayunpaman, ang mga kalamangan na ito ay dapat batay sa napakahalagang pagsunod ng mga sumusunod na kundisyon:
- tamang koleksyon, transportasyon ng biological material;
- pagkakaroon ng mga sterile, disposable na instrumento, mga espesyal na laboratoryo at bihasang tauhan;
- mahigpit na pagsunod sa diskarteng at kawalan ng lakas sa panahon ng pag-aaral
Ang mga kakayahang likas sa pag-aaral ng PCR ay nagbibigay-daan sa iyo upang makamit ang walang kapantay na pagtutukoy ng analitikal. Nangangahulugan ito na kilalanin nang eksakto ang microorganism na iyong hinahanap, at hindi isang katulad o malapit na nauugnay.
Ang pagiging sensitibo sa diagnostic at pagiging tiyak ng pamamaraan ng PCR ay madalas na higit kaysa sa pamamaraan ng kultura, na tinatawag na "pamantayang ginto" para sa pagtuklas ng mga nakakahawang sakit. Isinasaalang-alang ang tagal ng paglago ng kultura (mula sa maraming araw hanggang ilang linggo), ang kalamangan ng pamamaraang PCR ay nagiging halata.
PCR sa diagnosis ng mga impeksyon
Ang mga pakinabang ng pamamaraan ng PCR (pagiging sensitibo at pagiging tiyak) ay tumutukoy sa isang malawak na hanay ng mga aplikasyon sa modernong gamot.
Ang mga pangunahing lugar ng aplikasyon ng mga diagnostic ng PCR:
- mga diagnostic ng talamak at talamak na mga nakakahawang sakit ng iba't ibang lokalisasyon
- pagsubaybay sa pagiging epektibo ng therapy
- paglilinaw ng uri ng pathogen
Ang paggamit ng mga diagnostic ng PCR ay isinasagawa kasabay ng iba pang mga pamamaraan ng pagsasaliksik (ELISA, PIF, RIF, atbp.). Ang kanilang kumbinasyon at pagiging naaangkop ay natutukoy ng dumadating na manggagamot.
Nakakahawang mga ahente na nakita ng PCR
Mga Virus:
- retroviruses HIV-1 at HIV-2
- herpetiform na mga virus
- herpes simplex virus uri 1 at 2
Ang reaksyon ng Polymerase chain (PCR, PCR - reaksyon ng polymerase chain) ay isang paraan ng pagkuha ng maraming mga kopya ng mga tukoy na mga fragment ng DNA (genes) sa isang biological sample.
Ang kakanyahan ng PCR bilang isang pamamaraan ng molekular biology ay binubuo sa maraming pumipiling kopya ng isang tiyak na gene (seksyon ng DNA) na gumagamit ng mga espesyal na enzyme sa ilalim ng mga kondisyon sa vitro... Ang isang mahalagang tampok ng PCR ay ang pagkuha ng mga kopya ng isang tukoy na rehiyon ng DNA (gene) na nakakatugon sa mga tinukoy na kundisyon. Ang kasingkahulugan ng proseso ng pagkopya ng DNA ay "amplification". Pagtitiklop ng DNA sa vivo maaari ring maituring na pagpapalaki. Gayunpaman, hindi katulad ng pagtitiklop, ang mga maiikling seksyon ng DNA (maximum na 40,000 base na pares) ay pinalakas sa panahon ng reaksyon ng polymerase chain.
Pangunahing mga prinsipyo
Kaya, ang PCR ay ang paulit-ulit na pagkopya ng ilang mga fragment ng DNA na vitro sa panahon ng paulit-ulit na mga siklo ng temperatura. Paano nagpapatuloy ang proseso ng reaksyon sa loob ng isang siklo ng temperatura?
Ang pagbuo ng isang chain ng nucleotide ay isinasagawa ng enzyme DNA polymerase. Gayunpaman, upang makapagsimula, ang enzyme ay nangangailangan ng isang launch pad. Ang mga site ay "primers" (primers) - synthetic oligonucleotides 15-20 nucleotides ang haba. Dapat mayroong dalawang mga primer (pasulong at baligtarin), ang mga ito ay pantulong sa mga rehiyon ng template ng DNA, at ito ang fragment ng DNA na nililimitahan ng mga panimulang primer na makopya ng maraming beses sa pamamagitan ng DNA polymerase. Ang gawain ng polymerase ay ang sunud-sunod na pagdaragdag ng mga nucleotide na pantulong sa pagkakasunud-sunod ng template ng DNA. Sa gayon, sa isang siklo ng temperatura, dalawang bagong mga fragment ng DNA ang muling na-synthesize (dahil ang DNA Molekyul ay doble ang straced, may una nang dalawang matrices). Samakatuwid, higit sa 25-35 na mga pag-ikot, bilyun-bilyong mga kopya ng rehiyon ng DNA na tinutukoy ng mga primer ay naipon sa test tube. Ang istraktura ng isang indibidwal na pag-ikot ay maaaring kinatawan bilang mga sumusunod:
- DNA denaturation (natutunaw, pagkakaiba-iba ng mga hibla ng DNA) - 95 ° - - 1 o 2 minuto;
- pagsusubo ng mga primer (ang mga primer ay nagbubuklod sa template ng DNA, ang temperatura ng yugtong ito ay natutukoy ng komposisyon ng nucleotide ng panimulang aklat) - 60 ° C (halimbawa) - 1 minuto;
- Ang haba ng DNA (ang polymerase ay nag-synthesize ng isang DNA strand) - 72 ° C - 1 minuto (nakasalalay ang oras sa haba ng synthesized fragment).
Ang batayang instrumental para sa aplikasyon ng paraan ng reaksyon ng polymerase chain sa laboratoryo ay dapat na binubuo ng:
- (o, tulad ng tawag sa ito, isang thermal cycler);
- mga system para sa s (para sa pagpapakita ng mga resulta ng PCR);
- mga system (para sa pagsusuri ng mga resulta ng PCR);
- (para sa paghahanda ng sample);
- pagdayal (mekanikal o elektronikong).
Bilang karagdagan sa pangunahin at pandiwang pantulong na kagamitan para sa buong paggana ng PCR laboratoryo, kailangan ng ilang mga kinakain: mga sterile tip, test tubes, test tube racks at dispenser.
Ang base sa reagent sa isang maginoo PCR laboratoryo para sa pagsasagawa ng isang buong reaksyon ng polymerase chain ay may kasamang enzyme DNA polymerase na may buffer, primers (maliit na mga synthetic DNA fragment na pantulong sa simula at pagtatapos ng pinag-aralan na rehiyon ng template ng DNA), isang pinaghalong mga nucleotide (A, T, D, Ts). Ang purified water ay ganap ding mahalaga.
Mga kalamangan ng pamamaraan ng PCR
Mataas na pagiging sensitibo ng pag-aaral
Ang pagiging sensitibo ng pamamaraan ay tulad na posible na palakasin ang PCR at makilala ang target na pagkakasunud-sunod kahit na nangyayari ito minsan sa isang sample ng 10 5 cells.
Pagtitiyak sa pagtatasa
Pinapayagan ng PCR ang pagtuklas ng DNA ng isang tukoy na nakakahawang ahente sa pagkakaroon ng DNA ng iba pang mga mikroorganismo at ang DNA ng host organism, pati na rin ang pagsasagawa ng genotyping. Sa pamamagitan ng partikular na pagpili ng mga sangkap ng reaksyon (mga primer), maaari mong sabay na makita ang DNA ng mga malapit na nauugnay na mga mikroorganismo.
Pag-iiba-iba ng pamamaraan ng PCR
Ang totoo ay para sa mga diagnostic ng PCR ng mga nakakahawang sakit o namamana na mga sakit ng tao, maaaring magamit ang isa at ang parehong kagamitan, ang mga pangkalahatang pamamaraan para sa paghahanda ng mga sample (sample) at pagtatasa, pati na rin ang parehong uri ng mga reagent kit ay maaaring sundin.
Magtipid sa oras
Ang isang mahalagang bentahe ng PCR ay ang kawalan ng mga yugto ng gawaing kulturang microbiological. Ang halimbawang paghahanda, reaksyon at pagsusuri ng mga resulta ay pinakamadali na pinadali at na-automate sa maraming aspeto. Salamat dito, ang oras upang makuha ang resulta ay maaaring mabawasan sa 4-5 na oras.
Ang pagiging epektibo ng pamamaraan ng PCR
Ang lawak ng pinag-aralan na klinikal na materyal
Bilang isang sample sa reaksyon ng polymerase chain, hindi lamang ang biological na materyal mula sa pasyente ang maaaring magamit, kundi pati na rin ang iba pang mga substrate kung saan ang mga molekula ng DNA na may mataas na pagiging sensitibo ay maaaring makilala, halimbawa, tubig, lupa, pagkain, microorganism, washes at marami higit pa. ...
Ang lahat ng mga bentahe sa itaas ng natatanging pamamaraan na ito - mataas ang pagiging sensitibo at pagtitiyak, pagkilala ng isang nakakahawang ahente at genotyping ng anumang gen ng tao, mataas na kahusayan at pag-save ng oras, kagalingan ng kaalaman sa instrumento ng base - payagan ang pamamaraang PCR na malawakang magamit ngayon sa mga klinikal na diagnostic , kasanayan sa medisina, siyentipikong pagsasaliksik, kalidad ng kontrol at maraming iba pang mga lugar.
Application ng PCR
Ang mga patlang ng aplikasyon ng reaksyon ng polymerase chain bilang isang modernong pamamaraan ng molekular biology ay magkakaiba. Ito ay higit sa lahat dahil sa lawak ng materyal na maaaring masuri (halos lahat ng bagay kung saan maaaring ihiwalay ang higit pa o mas mataas na kalidad na DNA ay maaaring maging object ng pananaliksik), pati na rin ang mga napiling panimulang aklat. Ang mga pangunahing lugar ng aplikasyon ng PCR:
klinikal na gamot
- mga diagnostic ng mga nakakahawang sakit
- mga diagnostic ng namamana na sakit
- pagkakakilanlan ng mga mutasyon
- genotyping
- mga teknolohiya ng cell
- paglikha ng mga genetic passport
ekolohiya
- kapaligiran pagmamanman
- pagsusuri sa pagkain
- pagsusuri ng mga genetically binago na organismo (GMO)
forensic na gamot at forensics
- pagkakakilanlan
- pagtaguyod sa paternity
parmasyolohiya
beterinaryo
siyentipikong pagsasaliksik (molekular biology, genetika)
Organisasyon ng isang PCR laboratoryo
Pag-order ng impormasyon
| Pangalan | Dami | Paggawa | Pamamaraan | Pusa.Bilang |
|---|---|---|---|---|
Nagbibigay ang site ng impormasyon sa background para sa mga layuning pang-impormasyon lamang. Ang diagnosis at paggamot ng mga sakit ay dapat na isagawa sa ilalim ng pangangasiwa ng isang espesyalista. Ang lahat ng mga gamot ay may mga kontraindiksyon. Kinakailangan ang isang espesyalista na konsulta!
Pamamaraan reaksyon ng polymerase chain ay natuklasan halos tatlumpung taon na ang nakalilipas ng isang Amerikanong siyentipiko na nagngangalang Carrie Mullis... Ang pamamaraan ay laganap sa gamot bilang isang diagnostic tool, at ang kakanyahan nito ay binubuo sa pagkopya ng isang piraso ng DNA gamit ang isang espesyal na enzyme ( polimerase) artipisyal sa isang test tube.Sa anong mga larangan ng gamot ginagamit ang pamamaraang ito?
Bakit tapos ang pagkopya ng DNA at paano ito maghatid ng gamot?Pinapayagan ng pamamaraang ito ang:
- Ihiwalay at i-clone ang mga gen.
- Pag-diagnose ng mga sakit na genetiko at nakakahawa.
- Tukuyin ang paternity. Ang bata ay bahagyang nagmamana ng mga katangiang genetiko mula sa kanyang mga biological na magulang, ngunit sa parehong oras ay may kanya-kanyang natatanging pagkakakilanlang genetiko. Ang pagkakaroon ng ilang mga gen na magkapareho sa mga gen ng magulang sa kanya - pinapayagan kaming pag-usapan ang tungkol sa pagtatatag ng pagkakamag-anak.
Sa pinangyarihan ng krimen, ang mga forensic scientist ay nangongolekta ng mga sample ng materyal na genetiko. Kabilang dito ang: buhok, laway, dugo. Kasunod, salamat sa pamamaraan ng reaksyon ng polymerase, posible na palakasin ang DNA at ihambing ang pagkakakilanlan ng sample na kinuha sa genetikong materyal ng pinaghihinalaan.
Sa gamot, mabisang ginamit ang reaksyon ng polymerase chain:
- Sa pagsasanay sa baga - para sa pagkita ng pagkakaiba-iba ng mga uri ng bakterya at viral ng pulmonya, tuberculosis.
- Sa gynecological at urological na kasanayan - upang matukoy ang ureaplasmosis, chlamydia, mycoplasma infection, gardnerellosis, herpes, gonorrhea.
- Sa gastroenterological na kasanayan.
- Sa hematology - para sa pagpapasiya ng oncoviruses at impeksyon sa cytomegalovirus.
- Sa mabilis na pagsusuri ng mga nakakahawang sakit tulad ng viral hepatitis, dipterya, salmonellosis.
Sa kasalukuyan, ang pamamaraang ito ay pinaka-karaniwan sa pagsusuri ng mga nakakahawang sakit ( hepatitis ng viral etiology, HIV, mga sakit na nakukuha sa sekswal, tuberculosis, encephalitis na nakuha ng tick).
Ano ang nangyayari sa panahon ng reaksyon?
Ang reaksyon mismo ay hindi kumplikado sa chemically. Ang mapagkukunan ng DNA para sa reaksyon ay maaaring isang patak ng dugo, buhok, isang piraso ng balat, atbp. Sa teorya, ang isang reaksyon ay nangangailangan ng tamang mga reagent, isang test tube, isang biological sample, at isang mapagkukunan ng init. Pinapayagan ka ng reaksyon ng polymerase na makakita ng impeksyon, kahit na mayroon lamang isa o maraming mga DNA molekula ng pathogen sa sample ng biological na materyal.
Sa panahon ng reaksyon, salamat sa enzyme DNA polymerase, nangyayari ang pagdoble ( pagtitiklop) isang piraso ng DNA. Ang parehong parehong deoxyribonucleic acid ( pinaikling DNA) ay mahalaga para sa atin na nagbibigay ito ng pag-iimbak at paglipat ng impormasyong genetiko sa mga cell ng anak na babae. Ang DNA ay may anyo ng isang spiral, na binubuo ng mga paulit-ulit na bloke. Ang mga bloke na ito ay binubuo ng mga nucleotide, na kung saan ay ang pinakamaliit na piraso ng DNA. Ang mga nukleotide ay nabuo mula sa mga amino acid.
Ang proseso ng pagtitiklop ng mga seksyon ng DNA ay nangyayari sa panahon ng paulit-ulit na mga pag-ikot. Sa bawat naturang pag-ikot, hindi lamang ang orihinal na fragment ng DNA ang nakopya at dinoble, kundi pati na rin ang mga fragment na dumoble sa huling siklo ng amplification. Ang lahat ng ito ay kahawig ng isang proseso ng pag-unlad na geometriko.
Umiiral:
- Likas na paglaki ( iyon ay, ang proseso ng pagkopya at pagpaparami ng DNA), na nangyayari sa aming katawan at isang deterministikong, paunang natukoy na proseso.
- Artipisyal na pagpapalaki na nangyayari sa pamamagitan ng reaksyon ng polymerase chain. Sa kasong ito, ang proseso ng pagkopya ay kinokontrol at binibigyang-daan ka upang madoble kahit ang mga maikling seksyon ng nucleic acid.
Tatlumpu o apatnapung siklo sa paglaon, ang bilang ng mga fragment ay umabot sa maraming bilyon.
Para sa pagpapalakas sa vitro (sa vitro) kinakailangan na ang isang tukoy na banyagang fragment ng DNA ( iyon ay, ang DNA ay hindi sa pasyente, ngunit ng pathogen). Kung walang tukoy na fragment sa nilikha na solusyon, ang reaksyon ng kadena sa ilalim ng pagkilos ng polymerase ay hindi magpapatuloy. Ipinapaliwanag nito ang mataas na pagtutukoy ng PCR.
Mga yugto ng diagnostic ng PCR
1. Ang DNA ay ihiwalay mula sa materyal na pagsubok.2. Magdagdag ng DNA sa isang espesyal na solusyon ng mga nucleotide.
3. Ang solusyon ay pinainit sa temperatura na 90 - 95 degrees Celsius upang ang coagulate ng protina ng DNA.
4. Bawasan ang temperatura sa 60 degree.
5. Sa pag-uulit ng mga pag-ikot ng pagtaas at pagbawas ng temperatura, tataas ang bilang ng mga rehiyon ng nucleic acid.
6. Sa pamamagitan ng pagsasagawa ng electrophoresis, ang mga resulta ay naibuo at ang doble na mga resulta ay kinakalkula.
Ano ang mga pakinabang ng diagnosis na ito?
- Pagkakasunud-sunod: Ang anumang sample ng nucleic acid ay angkop para sa pamamaraang ito.
- Mataas na pagtutukoy: ang pathogen ay may natatanging mga pagkakasunud-sunod ng mga hibla ng DNA na kakaiba dito. Samakatuwid, ang mga resulta ng ginanap na PCR ay maaasahan, imposibleng malito ang gene ng isang pathogen sa gene ng isa pang pathogen.
- Pagkasensitibo sa pagkakaroon ng kahit isang solong Molekyul ng pathogen.
- Maliit na halaga ng materyal na kinakailangan para sa pagsasaliksik. Kahit isang patak ng dugo ang magagawa. Ang kakayahang makakuha ng isang resulta gamit ang isang minimum na dami ng sample ay napakahalaga para sa pediatric, neonatological, neurological research, pati na rin sa pagsasagawa ng forensic na gamot.
- Ang kakayahang makilala ang isang tamad, talamak na impeksyon, at hindi lamang isang matinding.
- Maraming mga kultura na nagdudulot ng sakit ay napakahirap linangin sa vitro ng iba pang mga pamamaraan, at pinahihintulutan ng reaksyon ng polymerase ang kultura na maipalaganap sa kinakailangang halaga.
Ano ang mga kawalan ng diagnosis na ito?
- Kung ang materyal na inilaan para sa PCR ay naglalaman ng DNA hindi lamang ng isang buhay na pathogen, kundi pati na rin ng isang namatay, ang paglakas ng parehong mga DNA ay magaganap. Alinsunod dito, ang paggamot pagkatapos ng diagnosis ay maaaring hindi ganap na tama. Pagkatapos ng ilang sandali, mas mahusay na suriin ang pagiging epektibo ng paggamot.
- Ang pagiging hypersensitive sa pagkakaroon ng mga mikroorganismo ay maaari ring isaalang-alang, sa ilang paraan, isang kawalan. Sa katunayan, normal sa katawan ng tao ay may kondisyon na pathogenic microflora, iyon ay, ito ang mga mikroorganismo na nabubuhay sa bituka, tiyan, at iba pang mga panloob na organo. Ang mga microorganism na ito ay maaaring makapinsala sa isang tao sa ilalim lamang ng ilang mga hindi kanais-nais na kondisyon - hindi pagsunod sa mga kinakailangan sa kalinisan, kontaminadong inuming tubig, atbp. Ang diskarteng PCR ay nagpapalaki ng DNA ng kahit mga microorganism na ito, kahit na hindi sila humantong sa patolohiya.
- Ang PCR ng iba't ibang mga sistema ng pagsubok ay maaaring magpakita ng mga resulta na magkakaiba sa kanilang sarili. Maraming pagbabago ng pamamaraang ito: " pugad», « walang simetrya», « baligtad», « dami»PCR at iba pa.