Pri diagnostike infekčných ochorení sa používajú rôzne laboratórne metódy na detekciu patogénov. Jedným z najprogresívnejších, špecifických a presných laboratórnych testov je analýza PCR, ktorá umožňuje určiť prítomnosť patogénov v krvi a iných typoch biologického materiálu, odhaliť mikroorganizmy v skorých štádiách vývoja ochorenia, v prípadoch infekcie.
PCR analýza na špeciálnom zariadení
Ako sa vykonávajú diagnostické testy pomocou PCR?
Polymerázová reťazová reakcia je laboratórna molekulárno-biologická metóda na detekciu DNA baktérií a húb, DNA a RNA vírusov. Základom PCR je špeciálna enzymatická reakcia, ktorá prebieha v prítomnosti špeciálnych enzýmov a látok molekulárnej povahy. Vzhľadom na to, že metóda je schopná priamo fixovať prítomnosť pôvodcu ochorenia, považuje sa za najinformatívnejšiu a najcitlivejšiu pri zisťovaní latentných infekcií a nosičstva v porovnaní so všetkými ostatnými diagnostickými metódami.
Analýza biologických vzoriek pomocou testovania PCR umožňuje rýchlo zistiť prítomnosť samotných baktérií a vírusov.
Iné laboratórne diagnostické metódy spravidla určujú nepriame príznaky infekcie alebo vyžadujú zdĺhavý testovací postup.
Hlavné fázy techniky PCR sú:
- odber biologického materiálu, jeho dodanie do diagnostického laboratória,
- izolácia genetického materiálu baktérií a vírusov z odobratého materiálu,
- priama analýza PCR a dekódovanie získaných údajov.
Na nastavenie PCR reakcie sa používajú vzorky tekutín, tkanív, sekrétov, v ktorých sa predpokladá prítomnosť patogénov. Najčastejšie používané vzorky na testovanie sú venózna krv, plazma alebo sérum. V laboratóriu sa oddelia bakteriálne a vírusové častice od ostatných zložiek a pomocou špeciálnych činidiel sa z nich izolujú molekuly DNA alebo RNA.
Polymerická reťazová reakcia
V ďalšej fáze sa tieto genetické molekuly mnohonásobne rozmnožia v špeciálnych zariadeniach. K tomu použite špeciálne enzýmy a molekuly, ktoré umožňujú umelo namnožiť presne definovaný typ DNA, ktorý patrí len jednému konkrétnemu patogénu. V dôsledku reakcie sa vytvorí obrovské množstvo krátkych fragmentov DNA, identických s tými, ktoré sú súčasťou vírusov a baktérií.
V tretej fáze sa nahromadené fragmenty detegujú pomocou špeciálnych farbív a detekčného zariadenia. Ak pôvodná vzorka obsahovala patogény, v dôsledku reakcie sa vytvorí špecifický produkt a analýza ukazuje pozitívny výsledok. Ak patogén nebol v materiáli, reakčný produkt sa nesyntetizuje a test dáva negatívny výsledok.
Testovanie PCR je jedným z najrýchlejších spôsobov diagnostiky infekcií. Celý cyklus kontroly materiálu trvá niekoľko hodín až jeden deň.
Metóda PCR - podstata
Práve využitie pri reakcii viacnásobnej reprodukcie molekúl DNA striktne definovaného typu umožňuje s extrémnou citlivosťou presne určiť prítomnosť mikroorganizmov v biologických vzorkách. Aj malá koncentrácia infekčných agens v tkanivách a telesných tekutinách môže viesť k syntéze obrovského množstva reakčného produktu a pozitívnemu záveru.
Aké infekcie určuje test PCR
Pomocou technológie PCR sa zisťuje prítomnosť širokého spektra baktérií, buniek podobných kvasinkám, vírusových častíc. V modernej diagnostickej praxi je najbežnejšia analýza PCR na identifikáciu pôvodcov nasledujúcich chorôb:
- HIV infekcia (AIDS),
- hepatitída (hepatitída B, hepatitída C a iné zriedkavejšie typy),
- cytomegalovírusová infekcia,
- takmer všetky infekčné choroby urogenitálneho traktu,
- kandidóza,
- mykoplazmóza,
- infekcie spôsobené herpetickými vírusmi,
- infekcia papilomavírusom,
- toxoplazmóza,
- črevné ochorenia,
- záškrt,
- tuberkulóza,
- zriedkavé fokálne infekcie,
- mononukleóza a mnohé ďalšie.
Polymerázová reťazová reakcia je najbežnejšia, spoľahlivá a rýchla metóda na detekciu genitálnych infekcií, hepatitídy, HIV, papilómov a iných ochorení.
Pri mnohých diagnostikovaných ochoreniach nie je PCR jediným spôsobom diagnostiky. Diagnózu potvrdí lekár až pri pozorovaní iných príznakov ochorenia.
Schéma detekcie vírusov a baktérií
Ale v mnohých prípadoch je polymerázová reakcia "zlatým štandardom" laboratórnej diagnostiky.
Zoznam infekcií zistených pomocou PCR sa každým rokom rozširuje. Vývoj metódy už umožnil určiť súčasne niekoľko patogénov. To poslúžilo na šírenie komplexných prieskumných programov. Medzi nimi: komplexná štúdia mikroflóry pre bakteriálnu vaginózu, stanovenie infekcií TORCH, identifikácia ľudských papilómov s vysokým a nízkym karcinogénnym rizikom. Okrem toho je v povinnom nemocničnom diagnostickom komplexe zahrnutý krvný test PCR.
Pomocou polymerázovej reakcie sa vedcom podarilo identifikovať molekuly, ktoré signalizujú vznik rôznych foriem zhubných nádorov – nádorové markery. Vďaka tomu našla metóda uplatnenie pri včasnom odhalení rakoviny. Testy PCR sa aktívne používajú na detekciu dedičných genetických defektov, a to aj pri prenatálnej diagnostike a počas plánovania tehotenstva.
Vlastnosti biologického materiálu pre analýzu PCR
Zber určitého typu materiálu na výskum je určený typom infekcie, ktorú chcú diagnostikovať ako výsledok testovania. Nasledujúce vzorky sa odoberajú ako skúšobné vzorky:
- venózna krv
- sliny,
- škrabance, napríklad z cervikálneho kanála, z vnútornej strany líca,
- vzorky hlienu,
- moč,
- pleurálna tekutina
- sekréty a prostaty,
- spútum a bronchopulmonálna laváž,
- výtok z močovej trubice.
Výsledky môžu dešifrovať iba špecialisti
Pri jednotlivých infekciách a pri špeciálnych indikáciách môžu lekári predpísať vyšetrenie cerebrospinálnej tekutiny. Pri zisťovaní vnútromaternicových ochorení sa využívajú vzorky placenty a plodovej vody.
Vo všeobecnosti sa na diagnostiku pomocou PCR používa typ materiálu, v ktorom je najpravdepodobnejšie prítomný samotný pôvodca ochorenia. Druh biologického materiálu určuje lekár pri odvolaní sa na analýzu.
Aby bola analýza presná a správna, je potrebná jednoduchá príprava pred odberom materiálu a dodržanie špeciálnej čistoty odberu vzoriek a vykonania samotnej analýzy.
Ak chcete získať presný výsledok analýzy, mali by ste dodržiavať niekoľko pravidiel na prípravu a zber materiálu na výskum:
- zrušiť pohlavný styk niekoľko dní pred odberom materiálu z pohlavných orgánov a v prípade diagnostikovania genitálnych infekcií krvným testom,
- ráno odobrať venóznu krv na PCR analýzu, pred pôrodom nekonzumovať nápoje a jedlo,
- nefajčite aspoň dve hodiny pred darovaním krvi,
- Ihneď po spánku zbierajte moč prísne do sterilnej nádoby.
Dôležité! Užívanie antibiotík a iných liekov môže skresliť výsledky testu. Pred odoslaním materiálu by ste sa mali poradiť so svojím lekárom.
Ak sa na vykonanie analýzy PCR plánuje odobrať materiál z genitálií, odporúča sa po konzultácii s ošetrujúcim lekárom zrušiť používanie antibakteriálnych hygienických produktov a silných liekov.
Ako dešifrovať výsledok analýzy PCR
Výsledky PCR sú zvyčajne prezentované v kvalitatívnom formáte. Infekčný agens sa vo vzorke biologického materiálu buď zistí, alebo sa v nej nezistí.
Interpretácia záveru je v tomto prípade čo najjednoduchšia:
- pozitívny výsledok naznačuje, že mikroorganizmus bol prítomný v analyzovanej vzorke,
- negatívny test naznačuje, že nebolo zistené žiadne infekčné činidlo.
Pozor! Negatívny výsledok je niekedy výsledkom nesprávneho odberu vzoriek alebo chýb v procese analýzy.
V prípade zjavných príznakov ochorenia a podozrenia na falošne negatívny výsledok môže byť vhodné zopakovať štúdiu.
PCR analýza vyžaduje veľkú presnosť
V špeciálnych prípadoch sa na stanovenie patogénu používajú kvantitatívne metódy. Výsledky takýchto analýz sú vydávané vo forme získanej koncentrácie DNA alebo RNA patogénu v zmysle určitého objemu materiálu. Napríklad v kópiách molekúl DNA na mililiter krvnej plazmy.
Kvantitatívna a semikvantitatívna PCR analýza a interpretácia jej výsledkov sa vykonávajú na sledovanie priebehu ochorenia, určenie vírusovej záťaže, identifikáciu štádia ochorenia a diagnostiku ochorení spôsobených podmienenými patogénmi.
Pozitívne aspekty diagnostiky PCR
Aktívne zavedenie metódy polymerázovej reťazovej reakcie pri diagnostike takého širokého spektra infekčných chorôb je možné vďaka mnohým jej výhodám:
- vysoká špecifickosť metódy - analýza umožňuje odhaliť presne definovaný typ DNA patogénov,
- schopnosť nastaviť analýzu na toku a automatizovať proces,
- vysoká citlivosť metódy a schopnosť diagnostikovať ochorenie v počiatočných štádiách,
- diagnostika niekoľkých infekcií súčasne;
- rýchlosť postupu a nízke náklady na spotrebný materiál.
Medzi nevýhody metódy patrí potreba drahého vybavenia, vysoké požiadavky na čistotu a vyrobiteľnosť laboratória, možnosť získania falošných výsledkov pri nedodržaní metódy rozboru.
Pre adekvátnu a účinnú liečbu mnohých infekčných ochorení je nevyhnutné včasné stanovenie presnej diagnózy. Pri riešení tohto problému sa dnes využívajú high-tech diagnostické metódy založené na metódach molekulárnej biológie. V súčasnosti je už v praktickej medicíne široko používaná polymerázová reťazová reakcia (PCR) ako najspoľahlivejší nástroj laboratórnej diagnostiky.
Čo vysvetľuje popularitu PCR v súčasnosti?
Po prvé, táto metóda sa používa na identifikáciu pôvodcov rôznych infekčných chorôb s vysokou presnosťou.Po druhé, sledovať účinnosť liečby.
V rôznych príručkách, brožúrach, článkoch, ale aj vysvetlivkách odborných lekárov sa často stretávame s používaním nezrozumiteľných výrazov a slov. Je naozaj ťažké hovoriť o high-tech produktoch vedy obyčajnými slovami.
Aká je podstata a mechanika PCR diagnostiky?
Každý živý organizmus má svoje vlastné jedinečné gény. Gény sa nachádzajú v molekule DNA, ktorá je v skutočnosti „vizitkou“ každého konkrétneho organizmu. DNA (genetický materiál) je veľmi dlhá molekula zložená zo stavebných blokov nazývaných nukleotidy. Pre každého pôvodcu infekčných chorôb sú umiestnené striktne špecificky, to znamená v určitom poradí a kombinácii. Keď je potrebné pochopiť, či má osoba konkrétny patogén, odoberie sa biologický materiál (krv, moč, sliny, náter), ktorý obsahuje DNA alebo fragmenty DNA mikróbov. Množstvo genetického materiálu patogénu je však veľmi malé a nie je možné povedať, ku ktorému mikroorganizmu patrí. Na vyriešenie tohto problému sa používa PCR. Podstatou polymerázovej reťazovej reakcie je, že sa odoberie malé množstvo materiálu na výskum, ktorý obsahuje DNA, a počas procesu PCR sa zvyšuje množstvo genetického materiálu prislúchajúceho konkrétnemu patogénu, a tak ho možno identifikovať.PCR diagnostika je genetická štúdia biomateriálu.
Myšlienka metódy PCR patrí americkému vedcovi K. Mullinsovi, ktorý navrhol v roku 1983. Široké klinické využitie však získal až v polovici 90. rokov XX. Poďme zistiť terminológiu, čo to je - DNA atď. Každá bunka akejkoľvek živej bytosti (zviera, rastlina, človek, baktérie, vírus) má chromozómy. Chromozómy sú správcami genetickej informácie, ktorá obsahuje celú sekvenciu génov každej konkrétnej živej bytosti.
Každý chromozóm pozostáva z dvoch reťazcov DNA stočených do špirály voči sebe navzájom. DNA je chemicky deoxyribonukleová kyselina, ktorá pozostáva zo štruktúrnych zložiek – nukleotidov. Existuje 5 typov nukleotidov – tymín (T), adenozín (A), guanín (G), cytozín (C) a uracil (U). Nukleotidy sú umiestnené jeden po druhom v prísnej individuálnej sekvencii a tvoria gény. Jeden gén môže pozostávať z 20-200 takýchto nukleotidov. Napríklad gén na produkciu inzulínu má dĺžku 60 párov báz.
Nukleotidy majú vlastnosť komplementarity. To znamená, že oproti adenínu (A) v jednom reťazci DNA je nutne tymín (T) v druhom reťazci a oproti guanínu (G) - cytozín (C). Schematicky to vyzerá takto:
G – C
T - A
A - T
Táto vlastnosť komplementarity je kľúčová pre PCR.
Okrem DNA má rovnakú štruktúru aj RNA – kyselina ribonukleová, ktorá sa od DNA líši tým, že namiesto tymínu používa uracil. RNA – je správcom genetickej informácie v niektorých vírusoch nazývaných retrovírusy (napríklad HIV).
Molekuly DNA a RNA sa môžu „rozmnožovať“ (táto vlastnosť sa využíva pri PCR). Deje sa to nasledovne: dve vlákna DNA alebo RNA sa od seba vzdialia, na každom vlákne sedí špeciálny enzým, ktorý syntetizuje nové vlákno. Syntéza prebieha podľa princípu komplementarity, to znamená, že ak je v pôvodnom reťazci DNA nukleotid A, potom v novo syntetizovanom bude T, ak G - potom C atď. Tento špeciálny enzým - "staviteľ" na začiatok syntézy potrebuje "semienko" - sekvenciu 5-15 nukleotidov. Toto „semeno“ je definované pre každý gén (gén chlamýdií, mykoplazma, vírusy) experimentálne.
Takže každý cyklus PCR pozostáva z troch etáp. V prvej fáze prebieha takzvané odvíjanie DNA – teda oddelenie dvoch spojených reťazcov DNA. V druhom je "semeno" pripojené k časti vlákna DNA. A nakoniec, predlžovanie týchto reťazcov DNA, ktoré produkuje enzým „staviteľ“. V súčasnosti celý tento zložitý proces prebieha v jednej skúmavke a pozostáva z opakovaných cyklov reprodukcie stanovenej DNA s cieľom získať veľké množstvo kópií, ktoré je možné následne odhaliť bežnými metódami. To znamená, že z jedného vlákna DNA získame stovky alebo tisíce.
Etapy výskumu PCR
Odber biologického materiálu na výskum
Ako vzorka sa používajú rôzne biologické materiály: krv a jej zložky, moč, sliny, výtok zo slizníc, mozgovomiechový mok, výtok z povrchov rany, obsah telových dutín. Všetky biologické testy sa odoberajú pomocou jednorazových nástrojov a zozbieraný materiál sa uzavrie do plastových sterilných skúmaviek alebo sa umiestni na kultivačné médium, po čom nasleduje preprava do laboratória.K odobratým vzorkám sa pridajú požadované činidlá a umiestnia sa do programovateľného termostatu – termocykléra (zosilňovača). V zosilňovači sa cyklus PCR opakuje 30-50 krát, pozostáva z troch etáp (denaturácia, žíhanie a predlžovanie). Čo to znamená? Poďme sa na to pozrieť bližšie.
Etapy priamej PCR reakcie, kopírovanie genetického materiálu
jaFáza PCR - Príprava genetického materiálu na kopírovanie.Vyskytuje sa pri teplote 95 ° C, pričom vlákna DNA sú oddelené a môžu na nich sedieť „semená“.
„Semená“ vyrábajú priemyselne rôzne výskumné a výrobné združenia a laboratóriá sa kupujú hotové. Zároveň „semienko“ na zisťovanie napríklad chlamýdií funguje len na chlamýdie atď. Ak sa teda biomateriál testuje na prítomnosť chlamýdiovej infekcie, potom sa do reakčnej zmesi umiestni „semeno“ na chlamýdie; ak sa biomateriál testuje na vírus Epstein-Barrovej, potom je to aj „semeno“ vírusu Epstein-Barrovej.
IIštádium – Spojenie genetického materiálu pôvodcu infekcie a „semena“.
Ak existuje DNA detegovaného vírusu alebo baktérie, „semeno“ sedí na tejto DNA. Tento proces pripojenia "priméru" je druhou fázou PCR. Táto fáza prebieha pri teplote 75 °C.
IIIštádium - Kopírovanie genetického materiálu pôvodcu infekcie.
Toto je proces skutočného predlžovania alebo reprodukcie genetického materiálu, ktorý sa vyskytuje pri 72 ° C. Enzým „staviteľ“ sa približuje k „semenám“ a syntetizuje nové vlákno DNA. S ukončením syntézy nového reťazca DNA končí aj cyklus PCR. To znamená, že v jednom cykle PCR sa množstvo genetického materiálu zdvojnásobí. Napríklad v pôvodnej vzorke bolo 100 molekúl DNA akéhokoľvek vírusu, po prvom cykle PCR bude vo vzorke už 200 molekúl DNA testovaného vírusu. Jeden cyklus trvá 2-3 minúty.
Na vytvorenie dostatočného množstva genetického materiálu na identifikáciu sa zvyčajne vykoná 30-50 cyklov PCR, čo trvá 2-3 hodiny.
Štádium identifikácie rozmnožovaného genetického materiálu
Samotná PCR v tomto bode končí a potom je tu rovnako významná etapa identifikácie. Na identifikáciu sa používa metóda elektroforézy alebo označené "priméry". Pri použití elektroforézy sa získané vlákna DNA oddelia podľa veľkosti a prítomnosť fragmentov DNA rôznych dĺžok indikuje pozitívny výsledok analýzy (to znamená prítomnosť jedného alebo druhého vírusu, baktérie atď.). Pri použití označených „primerov“ sa do výsledného reakčného produktu pridáva chromogén (farbivo), v dôsledku čoho je enzymatická reakcia sprevádzaná tvorbou farby. Vývoj farby priamo naznačuje, že v pôvodnej vzorke je prítomný vírus alebo iné detekovateľné činidlo. Dnes je možné pomocou označených „primerov“, ako aj príslušného softvéru okamžite „čítať“ výsledky PCR. Ide o takzvanú real-time PCR.
Prečo je diagnostika PCR taká cenná?
Jednou z významných výhod metódy PCR je jej vysoká citlivosť – od 95 do 100 %. Tieto výhody by však mali byť založené na nevyhnutnom dodržaní nasledujúcich podmienok:
- správny odber, preprava biologického materiálu;
- dostupnosť sterilných nástrojov na jedno použitie, špeciálnych laboratórií a vyškoleného personálu;
- prísne dodržiavanie techniky a sterility počas analýzy
Schopnosti, ktoré sú súčasťou analýzy PCR, vám umožňujú dosiahnuť neprekonateľnú analytickú špecifickosť. To znamená presne identifikovať mikroorganizmus, ktorý ste hľadali, a nie podobný alebo blízko príbuzný.
Diagnostická senzitivita a špecifickosť metódy PCR sú často lepšie ako pri kultivačnej metóde, ktorá sa nazýva „zlatý štandard“ na detekciu infekčných chorôb. Vzhľadom na trvanie rastu kultúry (od niekoľkých dní do niekoľkých týždňov) je výhoda metódy PCR zrejmá.
PCR v diagnostike infekcií
Výhody metódy PCR (senzitivita a špecifickosť) predurčujú široké možnosti využitia v modernej medicíne.
Hlavné oblasti použitia diagnostiky PCR:
- diagnostika akútnych a chronických infekčných ochorení rôznej lokalizácie
- sledovanie účinnosti terapie
- objasnenie typu patogénu
Použitie diagnostiky PCR sa uskutočňuje v spojení s inými metódami výskumu (ELISA, PIF, RIF atď.). Ich kombináciu a vhodnosť určuje ošetrujúci lekár.
Infekčné agens detekované pomocou PCR
Vírusy:
- retrovírusy HIV-1 a HIV-2
- herpetiformné vírusy
- vírus herpes simplex typu 1 a 2
Polymerázová reťazová reakcia (PCR, PCR – polymerázová reťazová reakcia) je metóda získania viacerých kópií špecifických fragmentov DNA (génov) v biologickej vzorke.
Podstata PCR ako metódy molekulárnej biológie spočíva vo viacnásobnom selektívnom kopírovaní určitého génu (sekcie DNA) pomocou špeciálnych enzýmov za podmienok in vitro... Dôležitou črtou PCR je získanie kópií špecifickej oblasti DNA (génu), ktorá spĺňa špecifikované podmienky. Synonymum pre proces kopírovania DNA je „amplifikácia“. replikácia DNA in vivo možno považovať aj za zosilnenie. Na rozdiel od replikácie sa však počas polymerázovej reťazovej reakcie amplifikujú krátke úseky DNA (maximálne 40 000 párov báz).
Základné princípy
PCR je teda opakované kopírovanie určitých fragmentov DNA in vitro počas opakovaných teplotných cyklov. Ako prebieha reakčný proces v rámci jedného teplotného cyklu?
Tvorba nukleotidového reťazca sa uskutočňuje pomocou enzýmu DNA polymerázy. Aby sme však mohli začať, enzým potrebuje štartovaciu rampu. Miesta sú "priméry" (priméry) - syntetické oligonukleotidy s dĺžkou 15-20 nukleotidov. Mali by existovať dva priméry (dopredný a reverzný), sú komplementárne s oblasťami templátu DNA a je to fragment DNA obmedzený primérmi, ktorý bude DNA polymeráza mnohokrát kopírovať. Úlohou polymerázy je postupné pridávanie nukleotidov, ktoré sú komplementárne k sekvencii templátu DNA. V jednom teplotnom cykle sa teda opäť syntetizujú dva nové fragmenty DNA (keďže molekula DNA je dvojvláknová, potom sú na začiatku dve matrice). V priebehu 25-35 cyklov sa teda v skúmavke nahromadia miliardy kópií oblasti DNA určenej primérmi. Štruktúru jednotlivého cyklu možno znázorniť takto:
- Denaturácia DNA (topenie, divergencia reťazcov DNA) - 95 ° С - 1 alebo 2 minúty;
- žíhanie primérov (priméry sa viažu na templát DNA, teplota tohto štádia je určená zložením nukleotidov priméru) - 60 ° C (napríklad) - 1 minúta;
- Predĺženie DNA (polymeráza syntetizuje vlákno DNA) - 72 ° C - 1 minúta (čas závisí od dĺžky syntetizovaného fragmentu).
Inštrumentálny základ pre aplikáciu metódy polymerázovej reťazovej reakcie v laboratóriu by mal pozostávať z:
- (alebo, ako sa tiež nazýva, tepelný cyklovač);
- systémy pre s (na vizualizáciu výsledkov PCR);
- systémy (na analýzu výsledkov PCR);
- (na prípravu vzorky);
- vytáčanie (mechanické alebo elektronické).
Okrem hlavného a pomocného vybavenia pre plné fungovanie laboratória PCR sú potrebné niektoré spotrebné materiály: sterilné špičky, skúmavky, stojany na skúmavky a dávkovače.
Reagenčná báza v bežnom PCR laboratóriu na uskutočnenie plnohodnotnej polymerázovej reťazovej reakcie zahŕňa enzým DNA polymerázu s pufrom, priméry (malé syntetické fragmenty DNA komplementárne so začiatkom a koncom analyzovanej oblasti templátu DNA), a zmes nukleotidov (A, T, D, Ts). Absolútne nevyhnutná je aj čistená voda.
Výhody metódy PCR
Vysoká citlivosť štúdie
Citlivosť metódy je taká, že je možné amplifikovať v PCR a identifikovať cieľovú sekvenciu, aj keď sa vyskytuje raz vo vzorke 10 5 buniek.
Špecifickosť analýzy
PCR umožňuje detekciu DNA špecifického infekčného agens v prítomnosti DNA iných mikroorganizmov a DNA hostiteľského organizmu, ako aj vykonanie genotypizácie. Špecifickým výberom reakčných zložiek (primérov) môžete súčasne detegovať DNA blízko príbuzných mikroorganizmov.
Všestrannosť metódy PCR
Faktom je, že na PCR diagnostiku infekčných chorôb alebo dedičných ľudských chorôb možno použiť jedno a to isté zariadenie, možno použiť univerzálne postupy prípravy vzoriek (vzoriek) a analýzy, ako aj rovnaký typ reagenčných súprav.
Ušetriť čas
Dôležitou výhodou PCR je absencia štádií kultúrnej mikrobiologickej práce. Príprava vzorky, reakcia a analýza výsledkov sú v mnohých ohľadoch maximálne uľahčené a automatizované. Vďaka tomu sa čas na dosiahnutie výsledku môže skrátiť na 4-5 hodín.
Účinnosť metódy PCR
Šírka študovaného klinického materiálu
Ako vzorka v polymerázovej reťazovej reakcii možno použiť nielen biologický materiál od pacienta, ale aj mnohé iné substráty, v ktorých možno identifikovať molekuly DNA s vysokou citlivosťou, napríklad vodu, pôdu, potraviny, mikroorganizmy, výplachy a mnohé iné. viac....
Všetky vyššie uvedené výhody tejto unikátnej metódy - vysoká citlivosť a špecifickosť, identifikácia infekčného agens a genotypizácia ľubovoľného ľudského génu, vysoká účinnosť a úspora času, všestrannosť prístrojovej základne - umožňujú dnes široké využitie metódy PCR v klinickej praxi. diagnostika, lekárska prax, vedecký výskum, kontrola kvality a mnohé ďalšie oblasti.
Aplikácia PCR
Oblasti použitia polymerázovej reťazovej reakcie ako modernej metódy molekulárnej biológie sú rôznorodé. Je to spôsobené najmä šírkou materiálu, ktorý je možné analyzovať (objektom výskumu sa môže stať takmer všetko, z čoho sa dá izolovať viac či menej kvalitná DNA), ako aj vybranými primermi. Hlavné oblasti použitia PCR:
klinickej medicíny
- diagnostika infekčných chorôb
- diagnostika dedičných chorôb
- identifikácia mutácií
- genotypizácia
- bunkové technológie
- vytváranie genetických pasov
ekológia
- monitorovanie životného prostredia
- analýza potravín
- analýza geneticky modifikovaných organizmov (GMO)
súdne lekárstvo a súdne lekárstvo
- identifikácia totožnosti
- určenie otcovstva
farmakológie
veterinárny
vedecký výskum (molekulárna biológia, genetika)
Organizácia laboratória PCR
Informácie o objednávke
| názov | Objem | Výroba | Metóda | Kat.číslo |
|---|---|---|---|---|
Stránka poskytuje základné informácie len na informačné účely. Diagnostika a liečba chorôb sa musí vykonávať pod dohľadom špecialistu. Všetky lieky majú kontraindikácie. Vyžaduje sa odborná konzultácia!
Metóda polymerická reťazová reakcia bol objavený takmer pred tridsiatimi rokmi americkým vedcom menom Carrie Mullis... Technika je rozšírená v medicíne ako diagnostický nástroj a jej podstatou je skopírovanie kúsku DNA pomocou špeciálneho enzýmu ( polymeráza) umelo v skúmavke.V akých oblastiach medicíny sa táto metóda používa?
Prečo sa kopíruje DNA a ako môže slúžiť medicíne?Táto technika umožňuje:
- Izolujte a klonujte gény.
- Diagnostikovať genetické a infekčné choroby.
- Určiť otcovstvo. Dieťa čiastočne zdedí genetické vlastnosti od svojich biologických rodičov, no zároveň má svoju jedinečnú genetickú identifikáciu. Prítomnosť niektorých génov identických s rodičovskými génmi v ňom umožňuje hovoriť o vytvorení príbuzenstva.
Na mieste činu kriminalisti odoberajú vzorky genetického materiálu. Patria sem: vlasy, sliny, krv. Následne je možné vďaka technike polymerázovej reakcie amplifikovať DNA a porovnať identitu odobratej vzorky s genetickým materiálom podozrivého.
V medicíne sa polymerázová reťazová reakcia účinne používa:
- V pľúcnej praxi - na rozlíšenie bakteriálnych a vírusových typov pneumónie, tuberkulózy.
- V gynekologickej a urologickej praxi - určiť ureaplazmózu, chlamýdie, mykoplazmovú infekciu, gardnerelózu, herpes, kvapavku.
- V gastroenterologickej praxi.
- V hematológii - na stanovenie onkovírusov a cytomegalovírusovej infekcie.
- Pri rýchlej diagnostike infekčných ochorení, ako je vírusová hepatitída, záškrt, salmonelóza.
V súčasnosti je táto metóda najbežnejšia v diagnostike infekčných ochorení ( hepatitída vírusovej etiológie, HIV, pohlavne prenosné choroby, tuberkulóza, kliešťová encefalitída).
Čo sa deje počas reakcie?
Samotná reakcia je chemicky nekomplikovaná. Zdrojom DNA pre reakciu môže byť kvapka krvi, vlasy, kúsok kože atď. Teoreticky si reakcia vyžaduje správne činidlá, skúmavku, biologickú vzorku a zdroj tepla. Polymerázová reakcia umožňuje odhaliť infekciu, aj keď je vo vzorke s biologickým materiálom len jedna alebo niekoľko molekúl DNA patogénu.
V priebehu reakcie dochádza vďaka enzýmu DNA polymeráze k zdvojeniu ( replikácia) kúsok DNA. Tá istá deoxyribonukleová kyselina ( skrátená DNA) je pre nás dôležitý tým, že zabezpečuje ukladanie a prenos genetickej informácie do dcérskych buniek. DNA má tvar špirály, ktorá sa skladá z opakujúcich sa blokov. Tieto bloky tvoria nukleotidy, ktoré sú najmenším kúskom DNA. Nukleotidy sa tvoria z aminokyselín.
Proces replikácie úsekov DNA nastáva počas opakujúcich sa cyklov. V každom takomto cykle sa skopíruje a zdvojnásobí nielen pôvodný fragment DNA, ale aj tie fragmenty, ktoré sa už zdvojnásobili v poslednom amplifikačnom cykle. To všetko sa podobá procesu geometrickej progresie.
Existuje:
- Prirodzené zosilnenie ( teda proces kopírovania a množenia DNA), ktorý sa vyskytuje v našom tele a je deterministickým, vopred určeným procesom.
- Umelé zosilnenie, ku ktorému dochádza prostredníctvom polymerázovej reťazovej reakcie. V tomto prípade je proces kopírovania riadený a umožňuje duplikovať aj krátke úseky nukleovej kyseliny.
O tridsať alebo štyridsať cyklov neskôr počet fragmentov dosiahne niekoľko miliárd.
Na zosilnenie in vitro (in vitro) je potrebné, aby špecifický cudzí fragment DNA ( to znamená, že DNA nepochádza od pacienta, ale od patogénu). Ak vo vytvorenom roztoku nie je žiadny špecifický fragment, reťazová reakcia pod pôsobením polymerázy neprebehne. To vysvetľuje vysokú špecifickosť PCR.
Etapy diagnostiky PCR
1. DNA sa izoluje z testovaného materiálu.2. Pridajte DNA do špeciálneho roztoku nukleotidov.
3. Roztok sa zahreje na teplotu 90 - 95 stupňov Celzia, aby sa proteín DNA zrazil.
4. Znížte teplotu na 60 stupňov.
5. S opakovaním cyklov zvyšovania a znižovania teploty sa zvyšuje počet oblastí nukleových kyselín.
6. Výsledky sa spočítajú elektroforézou a vypočítajú sa výsledky zdvojnásobenia.
Aké sú výhody tejto diagnózy?
- Všestrannosť: Pre túto metódu je vhodná akákoľvek vzorka nukleovej kyseliny.
- Vysoká špecifickosť: patogén má jedinečné sekvencie reťazcov DNA, ktoré sú preň charakteristické. Preto budú výsledky vykonanej PCR spoľahlivé, nie je možné zameniť gén jedného patogénu s génom iného patogénu.
- Citlivosť na prítomnosť čo i len jednej molekuly patogénu.
- Malé množstvo materiálu potrebného na výskum. Postačí aj kvapka krvi. Schopnosť získať výsledok s použitím minimálneho objemu vzorky je veľmi dôležitá pre pediatrický, neonatologický, neurologický výskum, ako aj v praxi súdneho lekárstva.
- Schopnosť identifikovať pomalú, chronickú infekciu, a nie len akútnu.
- Mnoho kultúr spôsobujúcich choroby je veľmi ťažké kultivovať in vitro inými metódami a polymerázová reakcia umožňuje množenie kultúry v požadovanom množstve.
Aké sú nevýhody tejto diagnózy?
- Ak materiál určený na PCR obsahuje DNA nielen živého patogénu, ale aj mŕtveho, dôjde k amplifikácii oboch DNA. Preto liečba po diagnóze nemusí byť úplne správna. Po chvíli je lepšie skontrolovať účinnosť liečby.
- Určitým spôsobom za nevýhodu možno považovať aj precitlivenosť na prítomnosť mikroorganizmov. Normálne v ľudskom tele existuje podmienene patogénna mikroflóra, to znamená, že ide o mikroorganizmy, ktoré žijú v črevách, žalúdku a iných vnútorných orgánoch. Tieto mikroorganizmy môžu človeku ublížiť len za určitých nepriaznivých podmienok – nedodržiavanie hygienických požiadaviek, kontaminovaná pitná voda a pod. Technika PCR amplifikuje DNA aj týchto mikroorganizmov, hoci nevedú k patológii.
- PCR rôznych testovacích systémov môže ukázať výsledky, ktoré sa budú medzi sebou líšiť. Existuje mnoho modifikácií tejto techniky: “ vnorené», « asymetrické», « obrátený», « kvantitatívne»PCR a ďalšie.