T lymfocyty, alebo T bunky(z lat. t hymus "thymus") - lymfocyty, ktoré sa u cicavcov vyvíjajú v týmusu z prekurzorov - pretimocytov, ktoré doň vstupujú z červenej kostnej drene. V týmuse sa T-lymfocyty diferencujú získavaním receptorov T-buniek (TCR) a rôznych koreceptorov (povrchových markerov). Hrá dôležitú úlohu pri získanej imunitnej odpovedi. Zabezpečujú rozpoznanie a deštrukciu buniek nesúcich cudzie antigény, zosilňujú pôsobenie monocytov, NK buniek a podieľajú sa aj na zámene izotypov imunoglobulínov (na začiatku imunitnej odpovede B bunky syntetizujú IgM, neskôr prechádzajú na produkcia IgG, IgE, IgA).
Typy T-lymfocytov
Receptory T-buniek sú hlavnými komplexmi povrchových proteínov T-lymfocytov zodpovedných za rozpoznávanie spracovaných antigénov spojených s molekulami hlavného histokompatibilného komplexu (MHC). Hlavný komplex histokompatibility (MHC)) na povrchu buniek prezentujúcich antigén. Receptor T buniek je spojený s iným polypeptidovým membránovým komplexom, CD3. Funkcie komplexu CD3 zahŕňajú prenos signálov do bunky, ako aj stabilizáciu receptora T-buniek na povrchu membrány. Receptor T-buniek sa môže spájať s inými povrchovými proteínmi, ich koreceptormi. V závislosti od koreceptora a vykonávaných funkcií existujú dva hlavné typy T buniek.
T-pomocníci
T-helpers (z anglického helper - helper) - T-lymfocyty, ktorých hlavnou funkciou je posilňovanie adaptívnej imunitnej odpovede. Aktivujte T-killery, B-lymfocyty, monocyty, NK-bunky priamym kontaktom, ako aj humorálne, uvoľňovaním cytokínov. Hlavným znakom T-pomocníkov je prítomnosť molekuly koreceptora CD4 na povrchu bunky. T-pomocníci rozpoznávajú antigény, keď ich T-bunkový receptor interaguje s antigénom spojeným s molekulami hlavného histokompatibilného komplexu triedy II (angl. Hlavný histokompatibilný komplex II (MHC-II)).
T zabijaci
T-pomocníci a T-killerovia tvoria skupinu efektorové T-lymfocyty priamo zodpovedné za imunitnú odpoveď. Zároveň existuje ďalšia skupina buniek, regulačných T-lymfocytov, ktorého funkciou je regulovať aktivitu efektorových T-lymfocytov. Moduláciou sily a trvania imunitnej odpovede prostredníctvom regulácie aktivity T-efektorových buniek udržujú regulačné T-bunky toleranciu voči telu vlastným antigénom a zabraňujú vzniku autoimunitných ochorení. Existuje niekoľko mechanizmov supresie: priamy, s priamym kontaktom medzi bunkami, a vzdialený, uskutočňovaný na diaľku, napríklad prostredníctvom rozpustných cytokínov.
γδ T-lymfocyty
T-lymfocyty sú malá populácia buniek s modifikovaným T-bunkovým receptorom. Na rozdiel od väčšiny ostatných T buniek, pre ktoré sa vytvára receptor α (\ štýl zobrazenia \ alfa) a β (\ štýl zobrazenia \ beta) podjednotky, receptor T-buniek γ δ (\ štýl zobrazenia \ gama \ delta)- vytvorené lymfocyty γ (\ štýl zobrazenia \ gama) a δ (\ displaystyle \ delta) podjednotky. Tieto podjednotky neinteragujú s peptidovými antigénmi prezentovanými MHC proteínmi. Predpokladá sa, že γ δ (\ štýl zobrazenia \ gama \ delta) T-lymfocyty sa podieľajú na rozpoznávaní lipidových antigénov.
T-supresory
T-lymfocyty, ktoré zabezpečujú centrálnu reguláciu imunitnej odpovede.
Diferenciácia v týmusu
Štádiá diferenciácie T-lymfocytov
Všetky T bunky pochádzajú z hematopoetických kmeňových buniek červenej kostnej drene, ktoré migrujú do týmusu a diferencujú sa na nezrelé tymocyty... Týmus vytvára mikroprostredie potrebné na vývoj plne funkčného repertoáru T buniek, ktorý je obmedzený na MHC a je samotolerantný.
Diferenciácia tymocytov je rozdelená do rôznych štádií v závislosti od expresie rôznych povrchových markerov (antigénov). V najskoršom štádiu tymocyty neexprimujú koreceptory CD4 a CD8, a preto sú klasifikované ako dvojito negatívne (DN) (CD4-CD8-). V ďalšom štádiu tymocyty exprimujú oba koreceptory a nazývajú sa dvojito pozitívne (DP) (CD4 + CD8 +). Nakoniec v konečnom štádiu dochádza k selekcii buniek, ktoré exprimujú iba jeden z koreceptorov (anglicky Single Positive (SP)): buď (CD4+) alebo (CD8+).
Počiatočné štádium možno rozdeliť do niekoľkých čiastkových etáp. Takže v podštádiu DN1 (anglicky Double Negative 1) majú tymocyty nasledujúcu kombináciu markerov: CD44 + CD25 -CD117 +. Bunky s touto kombináciou markerov sa tiež nazývajú skoré lymfoidné progenitory (angl. Včasné lymfoidné progenitory (ELP)). Zatiaľ čo napredujú vo svojej diferenciácii, ELP sa aktívne delia a nakoniec strácajú schopnosť transformovať sa na iné typy buniek (napríklad B-lymfocyty alebo myeloidné bunky). Po prechode do podštádia DN2 (Double Negative 2) tymocyty exprimujú CD44 + CD25 + CD117 + a stávajú sa skorými progenitormi T-buniek (ang. Včasní progenitori T-buniek (ETP)). Počas subštádia DN3 (anglicky Double Negative 3) majú bunky ETP kombináciu CD44-CD25+ a vstupujú do procesu β-výber.
β-výber
Gény receptorov T-buniek pozostávajú z opakujúcich sa segmentov patriacich do troch tried: V (variabilné), D (diverzita) a J (spájanie). V procese somatickej rekombinácie sú génové segmenty, jeden z každej triedy, spojené dohromady (V (D) J-rekombinácia). Náhodná kombinácia sekvencií V (D) J segmentu vedie k jedinečným sekvenciám variabilných domén pre každý z receptorových reťazcov. Náhodná povaha tvorby sekvencií variabilných domén umožňuje tvorbu T buniek schopných rozpoznať veľké množstvo rôznych antigénov a v dôsledku toho poskytnúť účinnejšiu ochranu proti rýchlo sa vyvíjajúcim patogénom. Rovnaký mechanizmus však často vedie k vytvoreniu nefunkčných podjednotiek receptora T-buniek. Gény kódujúce β-podjednotku receptora sú prvé, ktoré prechádzajú rekombináciou v DN3 bunkách. Pre vylúčenie možnosti vzniku nefunkčného peptidu tvorí β-podjednotka komplex s invariantnou α-podjednotkou pre-T bunkového receptora, tvoriaci tzv. pre-T-bunkový receptor (pre-TCR). Bunky, ktoré nie sú schopné vytvoriť funkčný pre-TCR, zomierajú v dôsledku apoptózy. Tymocyty, ktoré úspešne prešli β-selekciou, prechádzajú do subštádia DN4 (CD44 -CD25 -) a podstupujú proces pozitívny výber.
Pozitívny výber
Bunky exprimujúce pre-TCR na svojom povrchu stále nie sú imunokompetentné, pretože nie sú schopné viazať sa na molekuly hlavného histokompatibilného komplexu. Rozpoznanie molekúl MHC receptorom T-buniek vyžaduje prítomnosť koreceptorov CD4 a CD8 na povrchu tymocytov. Tvorba komplexu medzi pre-TCR a CD3 coreceptorom vedie k inhibícii prestavieb génov β-podjednotky a súčasne aktivuje expresiu génov CD4 a CD8. Tým sa tymocyty stanú dvojito pozitívnymi (DP) (CD4 + CD8 +). DP tymocyty aktívne migrujú do kôry týmusu, kde interagujú s kortikálnymi epitelovými bunkami exprimujúcimi proteíny oboch tried MHC (MHC-I a MHC-II). Bunky, ktoré nie sú schopné interagovať s MHC proteínmi kortikálneho epitelu, podliehajú apoptóze, zatiaľ čo bunky, ktoré úspešne vykonávajú takúto interakciu, sa začínajú aktívne deliť.
Negatívny výber
Tymocyty, ktoré prešli pozitívnou selekciou, začnú migrovať ku kortikomedulárnej hranici týmusu. Akonáhle sú tymocyty v dreni, interagujú s telu vlastnými antigénmi, ktoré sú prezentované v kombinácii s MHC proteínmi na medulárnych tymických epiteliálnych bunkách (mTEK). Tymocyty aktívne interagujúce s vlastnými antigénmi podliehajú apoptóze. Negatívna selekcia zabraňuje vzniku samočinne sa aktivujúcich T buniek, ktoré môžu spôsobiť autoimunitné ochorenia, pretože sú dôležitým prvkom imunologickej tolerancie organizmu.
Obsah "CD8 lymfocyty. Antigén (Ag) reprezentujúci bunky. Klasifikácia antigénov (Ag).":T bunkový receptor... T bunky rozpoznávajú Ag pomocou dvoch typov membránových glykoproteínov – receptorov T buniek a CD3. Receptor T-buniek je heterodimér obsahujúci a- a p-reťazce (asi 98 % všetkých T-buniek) alebo 5-reťazce (asi 1,5-2 % buniek) s molekulovou hmotnosťou 40-50 kDa. Receptor T-buniek je členom nadrodiny molekúl na povrchu buniek podobných Ig zapojených do rozpoznávacích reakcií. Mechanizmy transmembránového prenosu z receptora T-buniek zostávajú neznáme; pravdepodobne sú spôsobené CD3, nekovalentne spojeným s receptormi T-lymfocytov.
Aktivácia T buniek
Na aktiváciu T buniek sú potrebné dva signály z makrofágov. Prvým signálom je prezentácia Ag, druhým je sekrécia aktivačného faktora (IL-1). Ten stimuluje syntézu IL-2 T-lymfocytmi, čím sa tieto bunky aktivujú (autokrinná regulácia). Súčasne sa zvyšuje expresia receptorov pre IL-2 (CD25) na membránach T-buniek.
Subpopulácie T-lymfocytov
Na základe povrchových značiek niekoľko subpopulácií T-lymfocytov vykonávanie rôznych funkcií. Pre diferenciácia T buniek použiť sadu monoklonálnych AT, odhaľujúcich povrchový marker CD-Ag [z angl. zhluk diferenciácie]. Všetko zrelé T bunky exprimovať povrchový CD3-Ag; okrem nej subpopulácie T-lymfocytov exprimujú aj iné CD-Ag.
CD4+ lymfocyty
CD4 membránové molekuly nesú rôzne populácie buniek, podmienene rozdelené na regulačné (pomocníci) a efektorové (T rzm).
T-pomocníci[z angličtiny. pomôcť] špecificky rozpoznať Ag a interagovať s makrofágmi a B bunkami počas indukcie humorálnej imunitnej odpovede. Pomer buniek CD4+/CD8+ je dôležitým parametrom na hodnotenie imunitného stavu; za normálnych podmienok je pomer CD4 + / CD8 + približne rovný dvom a odráža dominantný vplyv stimulačných faktorov na imunitnú odpoveď. V niektorých stavoch imunodeficiencie je pomer obrátený (menej ako I, to znamená, že dominujú bunky CD8 +), čo naznačuje prevládajúci vplyv imunosupresívnych účinkov; je základom patogenézy mnohých imunodeficiencií (napríklad AIDS).
Ag rozpoznávacie T-lymfocyty„Rozpoznať“ cudzí epitop vírusového alebo nádorového Ar v komplexe s molekulou MHC na plazmatickej membráne cieľovej bunky. T hzt [T-efektory hypersenzitívnych reakcií oneskoreného typu (HRT)] sprostredkovávajú reakcie HRT.
Prvou štúdiou je vždy výpočet leukocytového vzorca (pozri kapitolu "Hematologické štúdie"). Hodnotia sa relatívne aj absolútne hodnoty počtu periférnych krviniek.
Stanovenie hlavných populácií (T-bunky, B-bunky, prirodzené zabíjačské bunky) a subpopulácií T-lymfocytov (T-pomocníci, T-CTL). Na primárne štúdium imunitného stavu a detekciu závažných porúch imunitného systému WHO odporučila stanovenie pomeru CD3, CD4, CD8, CD19, CD16 + 56, CD4 / CD8. Štúdia umožňuje určiť relatívny a absolútny počet hlavných populácií lymfocytov: T bunky - CD3, B bunky - CD19, prirodzené zabíjačské (NK) bunky - CD3- CD16 ++ 56 +, subpopulácie T lymfocytov (T-pomocníci CD3 + CD4 +, T-cytotoxické CD3 + CD8 + a ich pomer).
Metóda výskumu
Imunofenotypizácia lymfocytov sa uskutočňuje pomocou monoklonálnych protilátok proti povrchovej diferenciačnej angíne na bunkách imunitného systému, metódou laserovej prietokovej cytofluorometrie na prietokových cytometroch.
Výber zóny na analýzu lymfocytov sa uskutočňuje podľa dodatočného markera CD45, ktorý je prítomný na povrchu všetkých leukocytov.
Podmienky odberu a skladovania vzoriek
Venózna krv odobratá z kubitálnej žily ráno, prísne nalačno, do vákuového systému po značku uvedenú na skúmavke. K2EDTA sa používa ako antikoagulant. Po odbere sa skúmavka so vzorkou pomaly 8-10 krát prevráti, aby sa krv zmiešala s antikoagulantom. Skladovanie a preprava prísne pri teplote 18-23 ° C vo zvislej polohe nie viac ako 24 hodín.
Nesplnenie týchto podmienok povedie k nesprávnym výsledkom.
Interpretácia výsledkov
T-lymfocyty (CD3+ bunky). Zvýšené množstvo naznačuje hyperaktivitu imunitného systému, pozoruje sa pri akútnej a chronickej lymfocytovej leukémii. Zvýšenie relatívneho indikátora sa zistí pri niektorých laterálnych a bakteriálnych infekciách na začiatku ochorenia, exacerbáciách chronických ochorení.
Zníženie absolútneho počtu T-lymfocytov naznačuje nedostatok bunkovej imunity, konkrétne nedostatok bunkového efektorového spojenia imunity. Zisťuje sa pri zápaloch rôznej etiológie, zhubných novotvaroch, po úrazoch, operáciách, infarkte, pri fajčení, užívaní cytostatík. Zvýšenie ich počtu v dynamike ochorenia je klinicky priaznivým znakom.
B-lymfocyty (CD19+ bunky) Pokles sa pozoruje pri fyziologickej a vrodenej hypogamaglobulinémii a agamaglobulinémii, pri novotvaroch imunitného systému, liečbe imunosupresívami, akútnych vírusových a chronických bakteriálnych infekciách, čo je stav po odstránení sleziny.
NK lymfocyty s fenotypom CD3-CD16++ 56+ Prirodzené zabíjačské bunky (NK bunky) sú populáciou veľkých granulovaných lymfocytov. Sú schopné lyzovať cieľové bunky infikované vírusmi a inými intracelulárnymi antigénmi, nádorové bunky, ako aj iné bunky alogénneho a xenogénneho pôvodu.
Nárast počtu NK buniek súvisí s aktiváciou antitransplantačnej imunity, v niektorých prípadoch sa pozoruje pri bronchiálnej astme, vyskytuje sa pri vírusových ochoreniach, náraste zhubných novotvarov a leukémií, v období rekonvalescencie.
T-pomocné lymfocyty s fenotypom CD3 + CD4 + Zvýšenie absolútneho a relatívneho množstva sa pozoruje pri autoimunitných ochoreniach, môže to byť pri alergických reakciách, niektorých infekčných ochoreniach. Toto zvýšenie svedčí o stimulácii imunitného systému na antigén a potvrdzuje hyperreaktívne syndrómy.
Zníženie absolútneho a relatívneho počtu T buniek naznačuje hyporeaktívny syndróm s porušením regulačnej väzby imunity, je patognomickým znakom infekcie HIV; vyskytuje sa pri chronických ochoreniach (bronchitída, zápal pľúc a pod.), solídnych nádoroch.
T-cytotoxické lymfocyty s fenotypom CD3 + CD8 + Zvýšenie sa zisťuje takmer u všetkých chronických infekcií, vírusových, bakteriálnych, protozoálnych infekcií. Je charakteristická pre infekciu HIV. Pokles sa pozoruje pri vírusovej hepatitíde, herpese, autoimunitných ochoreniach.
pomer CD4 + / CD8 +Štúdia pomeru CD4 + / CD8 + (CD3, CD4, CD8, CD4 / CD8) sa odporúča len na monitorovanie infekcie HIV a sledovanie účinnosti ARV terapie. Umožňuje určiť absolútny a relatívny počet T-lymfocytov, subpopulácií T-pomocníkov, CTL a ich pomer.
Rozsah hodnôt je 1,2–2,6. Pokles sa pozoruje pri vrodených imunodeficienciách (Di-Georgyho syndróm, Neelof, Wiskott-Aldrich), s vírusovými a bakteriálnymi infekciami, chronickými procesmi, vystavením žiareniu a toxickým chemikáliám, mnohopočetným myelómom, stresom, klesá s vekom, pri endokrinných ochoreniach, solídny nádorov. Je to patognomický znak infekcie HIV (menej ako 0,7).
Nárast hodnoty o viac ako 3 - s autoimunitnými ochoreniami, akútnou T-lymfoblastickou leukémiou, tymómom, chronickou T-leukémiou.
Zmena pomeru môže súvisieť s počtom pomocníkov a CTL u daného pacienta. Napríklad zníženie počtu CD4+ T buniek pri akútnej pneumónii na začiatku ochorenia vedie k zníženiu indexu, pričom CTL sa nemusí meniť.
Pre ďalší výskum a identifikáciu zmien v imunitnom systéme v patológiách vyžadujúce posúdenie prítomnosti akútneho alebo chronického zápalového procesu a stupňa jeho aktivity sa odporúča zaradiť počítanie počtu aktivovaných T-lymfocytov s fenotypom CD3+ HLA-DR+ a TNK-buniek s CD3+. CD16++56+ fenotyp.
T-aktivované lymfocyty s fenotypom CD3 + HLA-DR + Marker neskorej aktivácie, indikátor hyperreaktivity imunity. Podľa expresie tohto markera je možné posúdiť závažnosť a silu imunitnej odpovede. Objavuje sa na T-lymfocytoch po 3. dni akútneho ochorenia. Pri priaznivom priebehu ochorenia klesá do normálu. Zvýšenie expresie na T-lymfocytoch možno pozorovať pri mnohých ochoreniach spojených s chronickým zápalom. Jeho nárast bol zaznamenaný u pacientov s hepatitídou C, zápalom pľúc, infekciou HIV, solídnymi nádormi a autoimunitnými ochoreniami.
TNK lymfocyty s fenotypom CD3+CD16++CD56+ T-lymfocyty nesúce na svojom povrchu markery CD16 ++ CD 56+. Tieto bunky majú vlastnosti T aj NK buniek. Štúdia sa odporúča ako ďalší marker pri akútnych a chronických ochoreniach.
Ich pokles v periférnej krvi možno pozorovať pri rôznych orgánovo špecifických ochoreniach a systémových autoimunitných procesoch. Nárast bol zaznamenaný pri zápalových ochoreniach rôznej etiológie, nádorových procesoch.
Štúdium skorých a neskorých markerov aktivácie T-lymfocytov (CD3 + CD25 +, CD3-CD56 +, CD95, CD8 + CD38 +) dodatočne predpísané na posúdenie zmien v IS pri akútnych a chronických ochoreniach, na diagnostiku, prognózu, sledovanie priebehu ochorenia a terapiu.
T-aktivované lymfocyty s fenotypom CD3 + CD25 +, receptor pre IL2 CD25+ je marker včasnej aktivácie. Funkčný stav T-lymfocytov (CD3+) dokazuje počet exprimujúcich receptorov pre IL2 (CD25+). Pri hyperaktívnych syndrómoch sa počet týchto buniek zvyšuje (akútna a chronická lymfocytová leukémia, tymóm, rejekcia transplantátu), navyše ich zvýšenie môže naznačovať skoré štádium zápalového procesu. V periférnej krvi ich možno zistiť v prvých troch dňoch choroby. Zníženie počtu týchto buniek možno pozorovať pri vrodených imunodeficienciách, autoimunitných procesoch, infekcii HIV, plesňových a bakteriálnych infekciách, ionizujúcom žiarení, starnutí a otravách ťažkými kovmi.
T-cytotoxické lymfocyty s fenotypom CD8 + CD38 + Prítomnosť CD38+ na CTL lymfocytoch bola pozorovaná u pacientov s rôznymi chorobami. Informatívny indikátor pre infekciu HIV, popáleniny. Nárast počtu CTL s fenotypom CD8 + CD38 + sa pozoruje pri chronických zápalových procesoch, onkologických a niektorých endokrinných ochoreniach. Počas terapie sa indikátor znižuje.
Subpopulácia prirodzených zabíjačských buniek s fenotypom CD3-CD56+ Molekula CD56 je adhezívna molekula, ktorá sa bežne nachádza v nervovom tkanive. Okrem prirodzených zabíjačských buniek je exprimovaný na mnohých typoch buniek, vrátane T-lymfocytov.
Nárast tohto indikátora indikuje rozšírenie aktivity špecifického klonu zabíjačských buniek, ktoré majú nižšiu cytolytickú aktivitu ako NK bunky s fenotypom CD3-CD16+. Počet tejto populácie sa zvyšuje s hematologickými nádormi (EK-bunkový alebo T-bunkový lymfóm, plazmatický myelóm, aplastický veľkobunkový lymfóm), chronickými ochoreniami a niektorými vírusovými infekciami.
Pokles zaznamenávajú primárne imunodeficiencie, vírusové infekcie, systémové chronické ochorenia, stres, liečba cytostatikami a kortikosteroidmi.
CD95+ receptor- jeden z receptorov pre apoptózu. Apoptóza je zložitý biologický proces potrebný na odstránenie poškodených, starých a infikovaných buniek z tela. Receptor CD95 je exprimovaný na všetkých bunkách imunitného systému. Hrá dôležitú úlohu pri kontrole fungovania imunitného systému, keďže je jedným z receptorov apoptózy. Jeho expresia na bunkách určuje pripravenosť buniek na apoptózu.
Zníženie podielu CD95 + lymfocytov v krvi pacientov naznačuje narušenie účinnosti posledného štádia likvidácie defektných a infikovaných vlastných buniek, čo môže viesť k relapsu choroby, chronickosti patologického procesu, rozvoju autoimunitných ochorení a zvýšenie pravdepodobnosti transformácie nádoru (napríklad rakovina krčka maternice s papilomatóznou infekciou). Stanovenie expresie CD95 má prognostickú hodnotu pri myelo- a lymfoproliferatívnych ochoreniach.
Zvýšenie intenzity apoptózy sa pozoruje pri vírusových ochoreniach, septických stavoch, pri užívaní liekov.
Aktivované lymfocyty CD3 + CDHLA-DR +, CD8 + CD38 +, CD3 + CD25 +, CD95. Test odráža funkčný stav T-lymfocytov a odporúča sa na sledovanie priebehu ochorenia a kontrolu imunoterapie pri zápalových ochoreniach rôznej etiológie.
Pre niektoré baktérie (pôvodcovia tuberkulózy, lepry, moru) sú „biotopom“ makrofágy. Zachytené v dôsledku fagocytózy vo fagolyzozómoch sú patogény chránené pred protilátkami aj cytotoxickými T-lymfocytmi.
Potlačením aktivity lyzozomálnych enzýmov sa tieto baktérie aktívne množia vo vnútri bunky a stávajú sa tak príčinou akútneho infekčného procesu. Nie je náhoda, že choroby uvedené ako príklad sú klasifikované ako obzvlášť nebezpečné infekcie.
V tejto pomerne ťažkej situácii v tele však existujú sily, ktoré bránia šíreniu patogénov a sú primárne spojené s CD4 T bunkami zápalu.
Účasť tohto typu lymfocytov na organizácii imunitnej odpovede sa realizuje prostredníctvom aktivácie makrofágov. Aktivované makrofágy sa nielen vyrovnávajú s intracelulárnymi patogénmi, ale v niektorých prípadoch získavajú aj ďalšie vlastnosti, ktoré nie sú spojené s antibakteriálnym účinkom, napríklad schopnosť ničiť rakovinové bunky.
Na aktiváciu makrofágov sú potrebné dva signály.
Prvým z nich je interferón-gama (IF-gama). Je to najcharakteristickejší cytokín produkovaný zápalovými CD4 T bunkami. Pomocné T bunky nevylučujú tento cytokín a nemôžu aktivovať makrofágy normálnym spôsobom.
Druhým signálom pre aktiváciu makrofágov je povrchový TNF-alfa, ktorý je indukovaný k expresii potom, čo T-bunky rozpoznajú zápal imunogénu na membráne makrofágu. Protilátky proti TNF-alfa rušia účinok druhého signálu.
Cytotoxické T bunky sa stanú aktívnymi ihneď po rozpoznaní antigénu, uvedomujúc si potenciálnu pripravenosť molekulárneho aparátu zničiť cieľové bunky prostredníctvom procesu apoptózy alebo nekrózy. Naproti tomu zápalové CD4 T bunky po rozpoznaní antigénu na povrchu makrofágov trávia hodiny syntézou de novo mediátorov, ktoré aktivujú makrofágy. Novo syntetizované cytokíny zozbierané v mikrovezikulách prenikajú do makrofágov v mieste kontaktu s T bunkami. Takáto priama cesta, ako v prípade cytotoxických T-lymfocytov, je najekonomickejšia a funkčne opodstatnená, pretože neovplyvňuje susedné, neinfikované bunky.
V makrofágoch aktivovaných kontaktom s T-bunkami zápalu a v dôsledku sekrécie IF-gama dochádza k iniciovaniu množstva biochemických zmien, ktoré týmto bunkám dodávajú silné antibakteriálne vlastnosti (obr. 16). V podmienkach interakcie makrofágov s T-bunkami zápalu sa pozoruje efektívnejšia fúzia fagozómov, ktoré napadli baktérie, s lyzozómami, ktoré sú správcami proteolytických enzýmov, ktoré ničia intracelulárne patogény. Proces fagocytózy je sprevádzaný takzvanou kyslíkovou explóziou - tvorbou kyslíkových radikálov a oxidu dusnatého, ktoré majú baktericídnu aktivitu.
V podmienkach kostimulácie s TNF-alfa a IF-gama je tento proces oveľa aktívnejší. Okrem toho aktivované makrofágy zvyšujú expresiu molekúl MHC triedy II a receptora TNF-alfa, čo vedie k náboru ďalších naivných T buniek. Celý tento komplex udalostí poskytuje pomerne silnú bariéru proti intracelulárnym patogénom.
Zápalové T bunky interagujúce s makrofágmi nielen posilňujú intramakrofágové biochemické procesy, ale samy sa aktivujú a pôsobia ako organizátori mnohostrannej imunitnej odpovede na antigén.
Ryža. šestnásť.
Funkčná aktivita CD4 T buniek zápalu.
Infikované makrofágy sú hlavnými cieľmi CD4 T buniek zápalu. V dôsledku rozpoznania imunogénneho komplexu na makrofágoch CD4 exprimujú zápalové T bunky na svojom povrchu tumor nekrotizujúci faktor alfa (TNF-alfa) a zvyšujú produkciu interferónu-gama (IF-gama). Kombinované pôsobenie cytokínov zabezpečuje efektívnejšiu tvorbu fagolyzozómov, akumuláciu kyslíkových radikálov a oxidu dusnatého s baktericídnymi vlastnosťami, zvýšenie expresie molekúl MHC triedy II a zvýšenie produkcie tumor nekrotizujúceho faktora alfa. Takáto aktivácia biochemických procesov v makrofágoch prispieva nielen k intracelulárnej deštrukcii baktérií, ale určuje aj ďalšie začlenenie T buniek do imunitnej odpovede.
Infekčný proces, vyvolaný rozmnožovaním patogénov, odráža boj dvoch síl – samotného patogénu a imunitného systému hostiteľa. Napríklad morový patogén Yersenia pestis má schopnosť vyvolať syntézu vysoko polymerizovaného proteínu I, ktorý sa začína exprimovať na bunkovej stene pri kyslom pH. Je známe, že lokálne okyslenie nastáva v mieste kontaktu patogénu s makrofágom. To vyvoláva syntézu a expresiu proteínu I. Tento proteín, ktorý má silné adhezívne vlastnosti, podporuje účinnejšiu penetráciu patogénu do bunky. Okrem toho pomáha patogénu vyhnúť sa pôsobeniu lyzozomálnych enzýmov. Kyslé podmienky fagolyzozómov podporujú syntézu tohto ochranného proteínu pre patogén.
Makrofágy chronicky infikované intracelulárnymi baktériami môžu stratiť svoju schopnosť byť aktivované T bunkami. Hromadné začlenenie nových makrofágov do procesu nastáva, keď sa patogény uvoľňujú pod vplyvom synergického účinku na infikované bunky TNF-beta (lymfotoxín) a IF-gama - produkty aktivovaných CD4 T buniek zápalu (obr. 17).
Ryža. 17
CD4 T bunky zápalu ako organizátori komplexnej imunitnej odpovede.
Zápalové CD4 T bunky pri interakcii s makrofágmi nielen aktivujú makrofágy, ale samy sa aktivujú. Tým, že produkujú celý súbor cytokínov, sú organizátormi komplexného imunitného procesu. Cieľovými bunkami regulačného pôsobenia cytokínov sú makrofágy (1, 2, 5, 6), T bunky (3), prekurzory monocytovo-makrofágovej línie diferenciácie (4). Skratky: IF-gama - interferón-gama, LT (TNF-beta) - lymfotoxín (tumor nekrotizujúci faktor-beta), IL-2 - interleukín-2, IL-3 - interleukín-3, GM-CSF - granulocytovo-makrofágová kolónia -stimulačný faktor, MHF - makrofágový chemotaktický faktor (faktor makrofágovej chemotaxie), MIF - makrofágový inhibičný faktor (makrofágový inhibičný faktor).
Táto kombinácia cytokínov je účinná aj pri odumieraní fibroblastov – hlavných zložiek spojivového tkaniva, čím je zabezpečený prienik imunokompetentných buniek do miesta infekcie. Je jasné, že za podmienok mobilizácie imunitnej odpovede musí byť zásoba efektorových T buniek udržiavaná na vysokej úrovni. Makrofágmi aktivované zápalové T bunky získavajú ďalšie efektory prostredníctvom IL-2, čo podporuje proliferáciu a diferenciáciu antigén-špecifických T buniek.
Okrem T-efektorov sa získavajú aj samotné makrofágy. Toto sa vykonáva dvoma spôsobmi:
Po prvé, prostredníctvom indukcie diferenciácie makrofágov v kostnej dreni pod vplyvom IL-3 a faktora stimulujúceho kolónie granulocytov a makrofágov (GM-CSF);
Po druhé, novovzniknuté makrofágy pod vplyvom lymfotoxínu a makrofágového chemotaktického faktora začnú migrovať z krvného obehu do miesta infekcie, kde sa usadia, pričom dochádza k pôsobeniu makrofágov inhibujúceho faktora, ktorý znižuje ich pohyblivosť.
Súbor cytokínov produkovaných aktivovanými CD4 T bunkami zápalu po špecifickom rozpoznaní patogénu poskytuje multidisciplinárny vývoj bunkovej imunitnej odpovede. Bunky uvažovanej subpopulácie teda pôsobia ako organizátori adekvátnej imunitnej odpovede.
Aktiváciou buniek sa rozumie ich prechod z kľudového stavu do funkčne aktívneho stavu – makrofágy produkujú reaktívne formy kyslíka, žírne bunky vypudzujú granuly, svalové bunky sa sťahujú atď. V prípade lymfocytu znamená aktivácia aj opustenie dormantného stavu (G0), ale v trochu inom zmysle: pokojový lymfocyt je mimo bunkového cyklu a jeho aktivácia znamená vstup do cyklu. Tento dôsledok aktivácie lymfocytov je hlboko funkčný, keďže akémukoľvek prejavu funkcie lymfocytov musí predchádzať ich rozmnoženie (keďže počiatočný počet buniek v každom klone je malý). Neplatí to pre prirodzené zabíjačské bunky – lymfocyty, ktorých populácia nemá klonálnu štruktúru. Aktivácia NK buniek nie je spojená s proliferáciou a znamená prechod do stavu pripravenosti vykonávať cytotoxickú funkciu.
Molekulárny základ aktivácie T buniek
Aktivácia buniek, vrátane lymfocytov, je vždy spojená s expresiou mnohých génov. V prípade lymfocytov by aktivácia mala viesť predovšetkým k expresii génov, ktoré zabezpečujú proliferatívnu expanziu klonu. Podstata prípravy T buniek na proliferáciu spočíva predovšetkým v expresii génov pre autokrinný rastový faktor - IL-2 a jeho receptor, resp. a-reťazec tohto receptora, čo zabezpečuje dosiahnutie požadovanej úrovne afinity k cytokín, ktorý slúži ako podmienka na to, aby receptor plnil svoje funkcie. Oba tieto gény sú indukovateľné, t.j. v kľudovom stave sú vypnuté, ale prejavujú sa ako odpoveď na indukčný účinok. Signál na zapnutie génu prichádza z jeho regulačnej (promótorovej) oblasti, ktorá obsahuje miesta pre špecifickú interakciu s určitými proteínmi – transkripčné faktory. Niektoré z týchto proteínov sú spočiatku prítomné v bunke v aktívnej forme, ale väčšina chýba a možno ich syntetizovať de novo alebo aktivovať fosforyláciou alebo odstránením inhibičnej podjednotky. Molekulárnym základom aktivácie je teda tvorba potrebných transkripčných faktorov, ktoré zabezpečujú aktiváciu indukovateľných génov.
Induktory aktivácie majú aktivačný účinok na T-lymfocyty. Za fyziologických podmienok je takýto induktor antigénnym stimulom. Samotné rozpoznanie antigénu pri kontakte T-helper s APC nemôže ovplyvniť aktivitu génu v dôsledku priestorovej disociácie membránového receptora a génov lokalizovaných v jadre. TCR vstupuje do bunky po naviazaní na antigén, ale nie preto, aby migroval do jadra a ovplyvnil aktivitu génu, ale aby sa odštiepil. Keď sa však antigénny komplex naviaže na TCR, v kombinácii s kostimulačným účinkom vzniká signál, ktorý sa dostane do jadra a reguluje génovú expresiu. Prenos signálu sa uskutočňuje podľa kaskádového princípu. V rôznych štádiách prenosu signálu ho vykonávajú molekuly enzýmov (hlavne proteínkinázy, ktoré aktivujú proteíny v každom nasledujúcom štádiu prenosu signálu), ako aj adaptorové a GTP-viažuce proteíny. Signál je spočiatku duálny, pretože sa prenáša súčasne z TCR a CD28. Potom sa tieto cesty pretnú a opäť rozdelia na niekoľko vetiev. Konečným výsledkom prenosu signálu pozdĺž každej signálnej dráhy je vytvorenie transkripčného faktora. Na obr. 3.90 ukazuje typickú schému prenosu intracelulárneho signálu, ktorá vedie k tvorbe transkripčných faktorov a aktivácii génu. Aktivácia T buniek vyžaduje vytvorenie troch transkripčných faktorov – NF-AT, NF-kB a AP-1. Ďalej sa budeme zaoberať implementáciou prenosu intracelulárneho signálu na príklade aktivácie T-pomocníkov počas rozpoznávania antigénu prezentovaného dendritickými bunkami.
Väzba komplexu MHC-II-peptid indukuje konformačné zmeny v molekule TCR a pridruženej molekule jadra receptora CD4. Zatiaľ nie je definitívne známe, či dochádza len k zmene konformácie receptorov alebo dochádza k ich oligomerizácii. Takéto zmeny aktivujú tyrozínkinázy spojené s receptorom a koreceptorom - Lck (p56lck) spojený s CD4 a Fyn (p59fyn) spojený s CD3. Tieto tyrozínkinázy sa nazývajú receptorové alebo proximálne, pretože priamo susedia s receptorom a vstupujú do receptorového komplexu. Obe tieto kinázy patria do rodiny kináz Src. Kinázy tejto rodiny obsahujú domény SH1, SH2 a SH3 (SH znamená Src-homológiu) (obr. 3.91). Prvá doména má enzymatickú aktivitu, zvyšok interaguje s inými kinázami a adaptorovými proteínmi. Funkciou tyrozínkináz je fosforylovať cieľové proteíny na tyrozínovom zvyšku, čo je nevyhnutné pre ich aktiváciu a prejavenie funkcií, vrátane enzymatických. Ciele receptorovej kinázy sú početné. Patria sem samotné molekuly Fyn a Lck (čo určuje ich autofosforyláciu), ako aj polypeptidové reťazce TCR a iné kinázy. Ciele Lck kinázy sú obzvlášť rôznorodé.
Počiatočnou podmienkou aktivácie receptorových kináz je však naopak ich defosforylácia, ktorá zabezpečuje re-
prejsť z hyperfosforylovaného do normálneho stavu. Ide o to, že v pokojovej bunke je doména SH2 Lck kinázy v zloženej forme v dôsledku fosforylácie C-koncového tyrozínového zvyšku Y505 konštitutívne aktivovanou Csk kinázou. Fosforylovaný Y505 interaguje prostredníctvom fosfátovej skupiny s tyrozínovým zvyškom v doméne Sffi, ku ktorému je pritiahnutý C-koniec molekuly. V tejto forme je enzým neaktívny, pretože v tomto prípade funkčne dôležitý zvyšok Y394 v doméne SH1 nemôže byť fosforylovaný. Na odstránenie takejto funkčnej blokády je potrebná defosforylácia, po ktorej nasleduje rozvinutie molekuly, ktoré sa uskutočňuje za účasti tyrozínfosfatáz. Hlavnú úlohu pri prenose receptorových kináz do „pracovného“ stavu zohráva molekula CD45, ktorej cytoplazmatická doména má aktivitu tyrozínfosfatázy. Už bolo spomenuté, že táto veľká molekula, ktorá bráni vytvoreniu úzkeho kontaktu medzi dendritickou bunkou a T-pomocníkom, je najskôr odstránená zo zóny imunitnej synapsie a potom sa časť molekúl vracia do tejto zóny, aby vykonala svoju funkcia - defosforylácia molekúl receptorovej tyrozínkinázy. Potom, čo sa zvyšok Y394 stane dostupným na fosforyláciu, môže Lck vykazovať tyrozínkinázovú aktivitu.
Pri generovaní signálov prenášaných z polypeptidových reťazcov komplexu TCR-CD3 je najdôležitejšia prítomnosť v cytoplazmatickej oblasti y-, 5-, e- a Z-reťazcov aktivačnej sekvencie ITAM, ktorá už bolo niekoľkokrát spomenuté. Štruktúra tohto motívu je nasledovná: YXXI / L / VX (6-8) YXXI / L / V (kde Y je tyrozín, X je akýkoľvek zvyšok, I / L / V je izoleucín, leucín alebo valín) (obr. 3,92). Fosforylácia tyrozínových zvyškov
Ryža. 3,92. Porovnanie charakteristík aktivačných a inhibičných motívov (ITAM a ITIM)
v ITAM sprístupňuje túto oblasť na rozpoznávanie analogickými oblasťami signálnych molekúl umiestnených distálne. Spomedzi polypeptidových reťazcov je TCR najdôležitejší pre prenos signálu, Z-reťazec. Na rozdiel od y-, 5- a e-reťazcov TCR, z ktorých každý má jednu ITAM oblasť, v cytoplazmatickej časti Z-reťazca sú 3 ITAM sekvencie určené na interakciu s tyrozínovými zvyškami tyrozínkinázy ZAP-70 ( zo Z-asociovaného proteínu - ^ - asociovaný proteín, hmotnosť 70 kDa) je kľúčovým faktorom pri prenose signálu z TCR, keď sa viaže na ligand. Fosforylácia Z-reťazca je najzodpovednejším a zároveň najzraniteľnejším štádiom aktivácie T-buniek. Predpokladá sa, že práve na zabezpečenie fosforylácie všetkých ITAM motívov tejto molekuly je potrebné dlhodobé udržiavanie kontaktu T-lymfocytov a dendritických buniek. V Z-reťazci pokojovej T-bunky je fosforylovaný 1 tyrozínový zvyšok; nedostatok fosforylácie vedie k rozvoju apoptózy (obr. 3.93). Po interakcii Z-reťazca a ZAP-kinázy,
Ryža. 3,94. Schéma signálnych dráh počas aktivácie T-buniek. Rozpoznanie komplexu MHC molekuly s antigénnym epitopom v kombinácii s kostimuláciou indukuje spustenie signálov prenášaných do jadra pomocou 5 kaskád, ktoré zabezpečujú tvorbu 3 transkripčných faktorov nevyhnutných pre aktiváciu bunky. Faktory, pri ktorých sa ukazuje vysoký stupeň závislosti od kostimulácie, sú zvýraznené hrubým písmom.
Celý proces je koncipovaný vo forme niekoľkých paralelných dráh prenosu aktivačného signálu (obr. 3.94).
Molekula ZAP-70 patrí medzi tyrozínkinázy rodiny Syk. Obsahuje tandem dvoch domén SH2. Podmienkou jeho interakcie s reťazcom je predbežná fosforylácia tyrozínových zvyškov v ITAM reťazca. Po fosforylácii 2. tyrozínový zvyšok v ITAM motívoch f-reťazca interaguje s tyrozínom S^-domén kinázy ZAP-70. Výsledkom je, že fosfátová skupina tyrozínového phreťazca sa stáva spoločnou s tyrozínom domény Sffi molekuly ZAP-70. Nasleduje fosforylácia tyrozínových zvyškov v enzymatickej doméne molekuly ZAP-70 tyrozínkinázami Lck a prípadne Fyn, čo vedie k aktivácii enzymatickej (kinázovej) aktivity molekuly.
Ďalší prenos signálu je spôsobený interakciou ZAP-70 s jeho hlavným substrátom - adaptorovým proteínom LAT (od Linker pre aktiváciu T-buniek - linker pre aktiváciu T-buniek). Tento proteín je spojený s membránou a je súčasťou raftov. Po fosforylácii katalyzovanej ZAP-70 získava LAT schopnosť viazať signálne molekuly zapojené do ďalšieho prenosu signálu: adaptorové proteíny SLP-76, Grb2, faktor Vav, ako aj enzýmy PLCy1 a PI3K. Aktivácia niektorých z týchto proteínov nie je priamo závislá od LAT, ale nepriamo. Takže cez domény SH3
adaptorových proteínov rodiny Grb2 sú faktory SLP-76 a Sos spojené so signálnou dráhou. SLP-76 zase sprostredkováva spojenie so signálnou dráhou PLCy1 a Ras GTPázy. K aktivácii PLCy1 dochádza za účasti tyrozínkinázy Itk, ktorá patrí do rodiny Btk, tretej (po Src a Syk) rodine tyrozínkináz zapojených do vnútrobunkovej signálnej transdukcie počas aktivácie lymfocytov. Všetky signalizačné faktory zapojené do procesu aktivácie s priamou a nepriamou účasťou LAT sa prijímajú do zloženia bunkovej membrány a interagujú s jej fosfoinozitidovými zložkami. Komplex vytvorený pri interakcii SLP-76, Vav a Nck reaguje s proteínmi cytoskeletu PAK a WASP, ktoré pôsobia ako mediátory prestavieb v cytoskelete aktivovaných buniek.
Aktivovaný PLCy1 katalyzuje štiepenie fosfatidylinozitol 4,5-bisfosfátu za vzniku diacylglycerolu (DAG), ktorý zostáva viazaný na membránu, a inozitol 1,4,5-trifosfátu (obr. 3.95). Inozitoltrifosfát vstupuje do cytoplazmy a interaguje s receptormi na povrchu endoplazmatického retikula, čo spôsobuje uvoľnenie iónov Ca2+ z vnútrobunkových zásob. Ich vyprázdnenie spôsobí otvorenie Ca2+-dependentných kanálov v bunkovej membráne, cez ktoré Ca2+ ióny z extracelulárneho priestoru vstupujú do bunky. V dôsledku toho sa zvyšuje koncentrácia voľných iónov Ca2 + v bunkovej cytoplazme. Ca2 + ióny aktivujú kalcineurín fosfatázu, ktorá defosforyluje cytoplazmatickú zložku transkripčného faktora NF-AT (Nuclear factor ofactivated T-cells) (obr. 3.96). To určuje pohyb faktora do jadra, interakciu s jadrovou zložkou a tvorbu zrelej formy molekuly NF-AT schopnej interagovať s DNA v promótorových oblastiach génov zapojených do aktivácie T buniek (IL2, IL2R atď.).
Diacylglycerol sa tradične považuje za faktor aktivujúci proteínkinázu C (PKC) – vyššie spomínaný serín/tre-
Ryža. 3,96. Ca2+-závislá väzba aktivácie T-buniek a jej blokáda cyklosporínom A. Signálna dráha závislá od inozitoltrifosfátu vedie k mobilizácii transkripčného faktora NF-AT do jadra. Túto dráhu môže blokovať cyklosporín A, ktorý je v kombinácii s cyklofylínom schopný inaktivovať kalcineurínfosfatázu, ktorá je zodpovedná za defosforyláciu cytoplazmatického faktora NF-AT (ktorý slúži ako podmienka jeho migrácie do jadra)
onínkináza, uznávaná ako jeden z kľúčových faktorov pri aktivácii T buniek. Ukázalo sa však, že izoformy PKC aktivované diacylglycerolom nesúvisia s aktiváciou T buniek. Ide o izoformu 0 PKC, ktorá sa objavuje v imunitnej synapsii na vrchole svojej „zrelosti“. Jeho nábor do imunitnej synapsie závisí od aktivity P13K a Vav (posledný faktor je spojený s cytoskeletom, ktorého úloha pri transporte PKC0 je veľmi dôležitá). Keďže aktivácia Vav závisí od signalizácie nielen prostredníctvom TCR, ale aj prostredníctvom CD28 a dráha závislá od CD28 sa realizuje za účasti PI3K (je spojená s CD28 - pozri nižšie), je zrejmé, že PI3K a Vav predstavujú rôzne štádiá rovnakej signálnej dráhy, a teda zapojenie molekuly PKC0 do aktivácie závisí od kostimulácie prostredníctvom CD28. V tomto prípade niet pochýb o úlohe signálov prichádzajúcich z TCR pri aktivácii PKC0, pretože PKC0 je fosforylovaný (a teda aktivovaný) kinázou Lck. Iné faktory, vrátane diacylglycerolu, sa môžu podieľať na aktivácii PKC0, ale tieto vplyvy sú sekundárne. Aktivácia PKC0 je potrebná na zabránenie apoptózy aktivovaných buniek a na zapnutie dvoch z troch kritických transkripčných faktorov potrebných na expresiu génov IL2 a IL2R - AP-1 a NF-kB. Aktivácia AP-1 závislá od РКС0 sa realizuje prostredníctvom Rac / JNK-vetvy MAP-kaskády (o nej bude diskutované nižšie). Dráha vedúca k aktivácii transkripčného faktora NF-kB obsahuje as
medziprodukty sekvenčne aktivovali (za účasti PKC0) faktory CARMA-1, Bcl-10 a MALT-1, IKK. IKK fosforyluje inhibičnú podjednotku NF-kB - IkK, čím získava schopnosť viazať ubikvitín, čo predurčuje jeho následnú degradáciu. V tomto prípade sa uvoľní aktívna podjednotka NF-kB, ktorá migruje do jadra a pôsobí ako transkripčný faktor - jeden z troch nevyhnutných pre expresiu génov pre aktiváciu T buniek. Transkripčný faktor NF-kB, ktorý hrá kľúčovú úlohu pri aktivácii buniek vrodenej imunity, bol diskutovaný vyššie (pozri časť 2.2.4).
Ďalšia signálna dráha spúšťaná aktiváciou T-lymfocytov - MAP-kaskáda, alebo MAP-modul (z mitogénom aktivovaných kináz - kináz aktivovaných mitogénom) - je rovnako široko používaná pri bunkovej aktivácii. Jeho úloha je najmä v indukcii transkripčného faktora AP-1 (c-jun / c-fos dimér). Existujú 3 vetvy tejto kaskády, čo vedie k vytvoreniu troch typov MAP kináz (MAP ^ - ERK1 / ERK2 (z Extracelulárnych signálom regulovaných kináz - kinázy regulované extracelulárnymi signálmi), p38 a JNK (z c-Jun NH2- terminálne kinázy - c Jun NH2-terminálne kinázy).Kaskády vedúce k aktivácii MAP-kináz sa aktivujú za účasti adaptorových proteínov a nízkomolekulových GTPáz Jeden z adaptorových proteínov Grb2 (Growth factor receptor bound protein 2), sa aktivuje interakciou s faktorom LAT. Aktivovaný Grb2 sa spontánne viaže na iný LAT-aktivovaný proteín SLP-76 a faktor Sos (od Son of sevenless) Sos je guanínový nukleotidový substitučný faktor: spôsobuje nahradenie GDP za GTP v malých G-proteínoch (t.j. proteínoch, ktoré viažu guanínové nukleotidy. Preto komplex SLP-76 / Grb2 / Sos spôsobuje aktiváciu Ras G-proteínu, pričom premieňa súvisiaci GDP na GTP. Ras-GTP aktivuje serín / treonín kinázu Raf (MAP kináza kináza kináza - MCCK).Nasleduje nasledujúca kaskáda reakcií: R af aktivuje MEK (MAP kinázová kináza - MCC) a MEK aktivuje vyššie uvedené MAP kinázy ERK1 a ERO. Aktivácia JNK vetvy MAP kaskády je iniciovaná vyššie uvedeným faktorom Vav (závislý od LAT a spojený s aktiváciou cytoskeletu, ako aj PKC0, pozri vyššie). Spôsobuje prechod GDP na GTP v komplexe s Rac G-proteínom (Rho rodina). Rac-GTP aktivuje MEKK kinázu (pôsobiacu ako ICRC), aktivuje JNKK kinázu (MKK), ktorá následne aktivuje JNK MAP kinázu. Tretia dráha MAP-modulu, ktorá vedie k tvorbe MAP-kinázy p38, tiež závisí od G-proteínov z rodiny Rho. Vo všeobecnej schéme je podobná ostatným dvom cestám, ale bola skúmaná menej podrobne.
MAP kinázy ERK1 / ERK2, JNK a p38 sú aktivované fosforyláciou treonínových a tyrozínových zvyškov v motíve TXY a úlohu X v troch typoch kináz zohrávajú rôzne zvyšky (Glu, Pro a Gly, v tomto poradí ). Tieto MAP kinázy sú zodpovedné za tvorbu transkripčných faktorov zapojených do mnohých bunkových procesov. ERK1 / ERK2 určuje tvorbu transkripčných faktorov AP-1 a Elk-1, JNK - faktory ATF2, Elk-1 a c-Jun (zložka AP-1), p38 - faktory ATF2, Elk-1 a MEF-2C.
K spusteniu signálnych dráh diskutovaných vyššie počas aktivácie T buniek dochádza paralelnou väzbou TCR a kostimuláciou prostredníctvom molekuly CD28. Diferenciácia signálnych dráh, ktoré sú zapínané cez tieto membránové molekuly, ako aj dešifrovanie interakcie týchto dráh nie sú úplne dokončené. Celkový obraz je však dostatočne jasný na to, aby poskytol všeobecné pochopenie molekulárneho základu kostimulácie. Keď je väzba TCR koordinovaná s väzbou koreceptora, zmení sa konformácia komplexu TCR-CD3, CD4 aktivuje receptorové tyrozínkinázy Fyn a Lck, ako aj fosfatázu CD45. Konečným výsledkom „proximálnych“ udalostí je fosforylácia Z-reťazca receptorového komplexu a prenos aktivačného signálu na kinázu ZAP-70. Ďalej, za účasti adaptorových proteínov LAT, SLP-76 a Vav je oblasť zapojená do signálnej transdukcie významne rozšírená, vrátane membránovo viazaných kináz, cytoskeletu a malých G-proteínov. Signálna dráha vedúca (cez aktiváciu PLCyl, tvorbu inozitoltrifosfátu a aktiváciu kalcineurínu) k mobilizácii Ca2+ a aktivácii transkripčného faktora NF-AT sa zjavne realizuje bez priamej účasti signálov generovaných počas kostimulácie. Ostatné dráhy sú viac-menej závislé od kostimulačného signálu.
Najpriamejším dôsledkom kostimulácie prostredníctvom CD28 je aktivácia membránového enzýmu PI3K, ktorý je fyzicky naviazaný na molekulu CD28. Tento enzým katalyzuje tvorbu fosfatidylinozitol-4,5-bisfosfátu, ktorý slúži ako zdroj inozitoltrifosfátu. Táto udalosť však priamo nesúvisí s aktiváciou a možno ju považovať za prípravnú. Po aktivácii buniek fosfatidylinozitoltrifosfát aktivuje Vav, nodálny faktor zodpovedný za zapojenie do procesu aktivácie cytoskeletu a zapojený do náboru a aktivácie proteínkinázy PKC0. Tento enzým je dôležitý pre fungovanie signálnej dráhy vedúcej k tvorbe transkripčných faktorov NF-kB a AP-1. V oboch prípadoch je úloha PKC0 najvýraznejšia pri aktivácii Rac / JNK vetvy MAP kaskády. Vetvy Raf / ERK a Rac / p38 kaskády MAP sú menej závislé od PKC0, a teda od kostimulácie. Molekulárnym základom kostimulácie je teda zapojenie signálnych dráh do aktivácie T-pomocníka, ktoré sa realizuje za účasti troch kľúčových faktorov – PI3K, faktora Vav, a izoformy 0 proteínkinázy C. Z troch kľúčových transkripčných faktorov, ktoré spúšťajú gény pre aktiváciu T-buniek, expresia dvoch (AP-1 a NF-kB) závisí od kostimulácie a len na produkciu NF-AT nie je potrebná priama kostimulácia.
V dôsledku toho sa v T-bunke tvoria 3 transkripčné faktory - NF-AT, NF-kB AP-1. K tvorbe týchto faktorov dochádza rôznymi spôsobmi. Aktívny NF-AT sa tvorí ako výsledok zostavenia diméru, ktorý zahŕňa cytoplazmatické a jadrové subkomponenty NF-AT - NF-ATc a NF-ATn. Ak je NF-ATn konštitutívnym faktorom vždy prítomným v jadre T-buniek, NF-ATc musí byť aktivovaný na migráciu do jadra, čo sa dosiahne jeho defosforyláciou katalyzovanou kalcineurínom (pozri vyššie). Transkripčný faktor NF-kB sa aktivuje odštiepením inhibičnej podjednotky IkB z komplexu IkB-NF-kB. Ako je uvedené vyššie, dochádza k tomu pri fosforylácii IkB pomocou IKK, ktorá sa aktivuje za účasti PKC0. Fosforylovaná podjednotka sa stáva dostupnou na degradáciu
pozdĺž ubikvitínovej dráhy. Faktor AP-1 je dimér proteínových produktov dvoch indukovateľných protoonkogénov, c-fos a c-jun. Na expresiu týchto génov a syntézu proteínov sú potrebné vhodné transkripčné faktory, konkrétne Elk-1 (pre c-fos) a JNK (pre c-jun). Ako bolo uvedené vyššie, Elk-1 a JNK sú konečnými produktmi aktivít rôznych odvetví kaskády MAP. Proteíny c-fos a c-jun syntetizované de novo tvoria homo- a heterodiméry, ktoré tvoria AP-1 transkripčný faktor.
Tri zvažované faktory (NF-AT, NF-kB a AP-1) sú potrebné na indukciu génov pre aktiváciu T buniek, predovšetkým IL2 a IL2R. Promótorová oblasť génu IL2 obsahuje 9 väzbových miest pre transkripčné faktory (obr. 3.97). Medzi nimi sú 2 väzbové miesta pre Octomer, čo neobmedzuje proces génovej indukcie. Z troch kľúčových transkripčných faktorov NF-kB interaguje s promótorom na jednom mieste, nezávisle od iných transkripčných faktorov. Dva ďalšie faktory, NF-AT a AP-1, interagujú s promótorom oddelene jeden od druhého (každý 1 väzbové miesto) a v komplexe (3 väzbové miesta). Naplnenie všetkých miest vhodnými transkripčnými faktormi, čo vedie ku génovej indukcii, je konečným výsledkom signálnej transdukcie po aktivácii T buniek.
Vyššie boli podrobne diskutované signálne dráhy zapojené do aktivácie T-pomocníkov. Cytotoxické T bunky sú aktivované podobnými mechanizmami.
3.5.2.2. Prejavy aktivácie T buniek
Aktivácia CD4+ T buniek (ako všetkých T lymfocytov) vedie k expresii veľkého počtu génov, medzi ktorými zohrávajú najväčšiu úlohu pri realizácii hlavných efektorových dejov gény IL2 a IL2R, kódujúce cytokín IL-2 a a-reťazca jeho receptora, resp. K expresii génu IL2 dochádza približne 1 hodinu po prijatí stimulačného signálu. Sekrécia IL-2 proteínu stimulovanými T bunkami in vitro sa deteguje po 3-4 hodinách; vrchol dosahuje po 8-12 hodinách a zastavuje sa po 24. In vivo sekrécia IL-2 začína 1-3 dni po podaní antigénu
Ryža. 3,98. Časová dynamika expresie aktivačných molekúl T-buniek. Na grafe
neukazujú načasovanie expresie kľúčových aktivačných molekúl po stimulácii T buniek
(imunizácia) a trvá 7-12 dní. Expresia α-reťazca IL-2 receptora nastáva o niečo neskôr a trvá dlhšie – in vitro sa deteguje 4 hodiny po stimulácii; svoje maximum dosiahne po 2-3 dňoch a ustane po 5 dňoch (obr. 3.98).
Súčasne s génom IL2 sa v čo najkratšom čase po pôsobení stimulantu (za fyziologických podmienok komplex antigénny peptid-MHC) exprimujú gény c-Myc a N-Myc, nazývané gény včasnej aktivácie. Podieľajú sa na príprave buniek na mitózu. Po 2-3 hodinách sa na povrchu T-bunky objaví CD69 - najskorší aktivačný antigén, čiastočne mobilizovaný z intracelulárnych zásob a čiastočne exprimovaný de novo. Jeho prejav trvá niečo vyše dňa. Čoskoro po CD69 sa na bunkovom povrchu objavuje ďalší skorý aktivačný marker CD25, ktorý predstavuje už spomínaný a-reťazec receptora pre IL-2. O niečo skôr bola detegovaná expresia množstva cytokínových génov a syntéza obmedzených množstiev zodpovedajúcich cytokínov (IFNy, IL-4, IL-5, IL-6).
Nasledujúce prejavy aktivácie sa pozorujú jeden deň po pôsobení stimulantu, keď sa exprimuje molekula transferínového receptora (CD71). Tento faktor hrá dôležitú úlohu pri proliferácii, pretože na jeho realizáciu sú potrebné ióny železa. V nasledujúcich dňoch (3-6 dní) sa exprimujú molekuly MHC-II, pripisované neskorým markerom aktivácie T-buniek, a potom sa exprimujú pl-integríny, označované ako antigény veľmi neskorej aktivácie - VLA (Very late aktivation antigens). a chemokíny sa vylučujú. Tieto neskoré prejavy aktivácie buniek sú kombinované s proliferatívnym procesom.